滞育是指昆虫面对即将到来的恶劣环境,主动进入一种极其缓慢的发育状态,等到外界的环境条件适宜时再重新启动发育。大量研究表明,昆虫的滞育主要受到神经肽以及激素的调控,棉铃虫的蛹滞育主要由于促前胸腺激素(PTTH)和蜕皮激素(ecdysone)合成分泌减少所引起的。昆虫滞育的生理生化研究揭示了能量代谢的活性下调是滞育的主要特征之一,但是调节机制尚不清楚。同时有报道表明,滞育型蛹个体中血淋巴中的葡萄糖水平低于发育型个体,但滞育型蛹脑中葡萄糖的水平却高于发育型蛹脑,其葡萄糖转运调节机制仍不清楚。乙酰化是重要的蛋白翻译后修饰,在生物体调控能量代谢过程中起到重要的作用,但是在滞育过程中的作用还没有报道。因此,本研究以蛹滞育的棉铃虫(Helicoverpa armigera)为研究材料,试图阐明乙酰化修饰对代谢的调节机制以及对滞育的影响,以及滞育型蛹脑中葡萄糖的转运调控机制。首先,我们克隆了重要的去乙酰化酶Sirt2,调查了该蛋白在棉铃虫滞育和发育个体中的表达差异。Western blot以及qPCR结果显示Sirt2 mRNA和蛋白水平在发育型蛹脑中的表达高于滞育型蛹脑;对棉铃虫蛹期代谢活性的调查显示,发育型蛹脑中丙酮酸含量和三羧酸循环活性远高于滞育型蛹脑;Sirt2抑制剂NAM注射进发育蛹后,丙酮酸含量和三羧酸循环活性显著下调,且蛹的发育延迟;丙酮酸注射进滞育蛹后,三羧酸循环活性显著上调,并且有打破滞育的效果。以上结果暗示Sirt2、丙酮酸是调控棉铃虫蛹期代谢活性的重要因子。接下来调查了和丙酮酸合成相关的三个代谢酶丙酮酸激酶(PK)、磷酸甘油酸变位酶(PGAM)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)在蛹期的表达模式。Western blot以及酶活测定结果表明这三个酶在发育型蛹脑中的蛋白表达或活性要高于滞育型蛹脑;PK、PGAM和PEPCK都存在乙酰化修饰;抑制剂NAM处理细胞后发现PK和PEPCK的蛋白水平显著下调,同时PGAM的酶活水平也显著下调;免疫共沉淀实验显示Sirt2与这些代谢酶有直接的结合,并通过去乙酰化修饰上调它们的蛋白水平或酶活。表明在滞育型蛹脑中,由于Sirt2表达下调,导致PK、PGAM和PEPECK蛋白乙酰化水平上升,三个酶表达水平或酶活下调,抑制了丙酮酸的合成;蛹脑中丙酮酸含量下调进而导致三羧酸循环活性下调,抑制蛹整体的代谢活性,从而进入滞育状态。胰岛素信号通路是调控生长发育的重要信号通路。棉铃虫滞育型蛹血淋巴中的胰岛素滴度低于发育型蛹,但是胰岛素通路中的关键蛋白激酶Akt的磷酸化水平在滞育型蛹脑中是显著高于发育型蛹脑。已有研究表明蛋白磷酸酶PP2A能够去Akt磷酸化,因此我们克隆了棉铃虫PP2A-B’基因,并制备多克隆抗体调查其在发育型和滞育型蛹脑中的表达差异。结果显示,PP2A-B’在发育预定型蛹脑中的蛋白表达水平明显高于滞育型蛹脑;免疫共沉淀证明PP2A-B’能够和Akt特异性结合;过表达PP2A-B’可以明显抑制Akt磷酸化;使用PP2A-B’抑制剂处理细胞后,p-Akt显著上升。这些结果表明,在滞育型蛹脑中,由于PP2A-B’蛋白表达下调,对Akt磷酸化的抑制作用减弱,导致p-Akt水平上升。最后,我们调查了滞育型蛹脑中高水平p-Akt所起的作用。已有的结果表明,滞育型蛹血淋巴中葡萄糖水平低于发育型蛹,但滞育型蛹脑中葡萄糖含量却高于发育型蛹脑,同时葡萄糖转运蛋白Glut的水平在滞育型蛹脑中也是高的。因此,我们推测在滞育型蛹脑中p-Akt可以促进Glut的表达。用Akt的抑制剂AI4处理细胞后发现,p-Akt和Glut的蛋白水平都有显著下降;用葡萄糖竞争性抑制剂DOG处理细胞或注射进发育型蛹,发现p-Akt和Glut的蛋白水平显著上升。这些结果暗示,在滞育型蛹脑中,高的p-Akt水平促进了Glut的表达,使得蛹脑可以吸收血淋巴中低水平的葡萄糖进脑,作为能源在漫长的滞育期缓慢利用。