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背景:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚未十分明确的慢性肠道非特异炎症性疾病。近年的统计资料显示,我国UC患者的数量较前明显增加,可能主要与近年来经济发展,人们饮食结构和生活方式的改变,环境改变,以及家族遗传和个体免疫等因素有关。UC患者病情的反复性及难治性,严重影响患者生活质量,并导致大量医疗资源消耗。因此,深入了解UC发病机制,以期望为临床寻找新的方法治疗UC患者提供一定理论基础。microRNAs(miRNAs)是一群短序列(约22个核苷酸),非编码蛋白质的单链小分子RNA,通过与靶基因mRNA3’-非编码区(3’-UTR)的miRNA辨别位点结合,调节靶mRNA的降解或翻译抑制。许多研究发现,miRNAs在细胞增殖、分化、凋亡和免疫反应等过程中发挥重要作用,提示细胞生命活动中众多信号转导途径可能由miRNAs参与调节。腺苷是一种内源性嘌呤核苷,主要通过结合并激活特异性的腺苷受体,在生理和病理条件下发挥重要作用。在生理、病理状态下,腺 苷A2a受体(A2aAR)mRNA和蛋白均可表达于人和动物胃肠道的各种组织、细胞,参与调节肠道免疫和炎症反应。大量研究发现,在肠道炎症发生时,肠黏膜中A2aAR的表达水平降低,而又有研究发现,miR-16也表达在肠黏膜上皮细胞并在肠道炎症发生时表达明显增加。既然两者都共同表达在肠黏膜上皮细胞中,并且在炎症发生时表达量都出现异常,那么两者在UC中的作用是否有一定的相关性,目前尚未见报道。因此本文探讨miR-16与A2aAR在UC中的相关性及其作用机制,以期今后应用miRNA与A2aAR进行疾病诊断及治疗等,改善UC患者的预后,提高其生存质量。第一部分miR-16与A2aAR在UC组织中表达及其相关性研究目的本研究了解UC组织中A2aAR的定位情况,检测miR-16、A2aARmRNA和A2aAR蛋白的表达,以及miR-16的异常表达与A2aAR表达量的相关性关系,初步探讨miR-16与A2aAR在UC的发生、发展过程中的可能机制。方法选取正常对照组20例、IBS组22例和活动期UC20组28例为研究对象;采用免疫荧光方法检测A2aAR蛋白在上述各组大肠黏膜组织中的定位;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述各组中大肠黏膜组织的miR-16及A2aAR mRNA表达水平;蛋白免疫印迹(western blot)检测A2aAR蛋白表达水平;分析UC组织中miR-16表达量与A2aAR mRNA和蛋白表达量的相关性关系。结果免疫荧光结果显示,A2aAR蛋白主要表达在大肠黏膜组织的上皮细胞。qRT-PCR结果显示,UC组中大肠黏膜组织miR-16相对表达量明显升高,分别与正常对照组和IBS组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。A2aARmRNA在UC组中表达明显降低,分别与正常对照组和IBS组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot的结果亦证实A2aAR蛋白在UC组中低表达,分别与正常对照组和IBS组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。在UC组中,高表达的miR-16与A2aARmRNA的表达量无显著性相关(r = 0.095,P>0.05),而与A2aAR蛋白表达量呈显著性负相关关系(r =-0.438,p<0.05)。结论miR-16和A2aAR在UC组织中存在差异表达,两者呈负性相关。miR-16可能通过调节A2aAR参与UC发生、发展过程。第二部分在肠上皮细胞中miR-16对A2aAR的调控作用研究目的了解miR-16表达的变化对A2aARmRNA和其蛋白的影响,研究miR-16对A2aAR的调控作用。方法通过生物信息学软件技术预测miR-16的靶基因,并采用双荧光素酶报告基因系统验证A2aAR是miR-16的靶基因。通过转染不同浓度的miR-16 mimics或miR-16 inhibitor及相应的NC至肠上皮细胞HT-29,应用qRT-PCR法检测miR-16和A2aAR mRNA的表达;western blot法检测A2aAR蛋白表达。结果利用Target Scan软件预测miR-16调控A2aAR的结合区域,显示A2aAR基因的3’-UTR端存在miR-16的结合位点。在分别共转染pmiR-A2aAR-wt质粒与 miR-16 mimics 或 miR-16 inhibitor 或各自的 NC 于 HT-29 细胞实验中,miR-16 mimics组与相应的NC组比较,荧光素酶活性显著下降,两组差异有统计学意义(P<0.05);miR-16 inhibitor组与相应的NC组比较,荧光素酶活性显著升高,两组差异有统计学意义(P<0.05);在共转染pmiR-A2aAR-mut质粒与miR-16 mimics或miR-16 inhibitor的实验中,与各自相应NC组比较,miR-16 mimics组或miR-16 inhibitor组荧光素酶活性均无显著变化,两组差异均无统计学意义(P>0.05)。在转染不同浓度的 miR-16 mimics 或 miR-16 inhibitor(50 nM、100 nM、150 nM)于HT-29细胞后,与各自相应的NC组比较,miR-16 mimics组miR-16的表达显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05),且A2aARmRNA和蛋白表达均显著下降,并呈浓度依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05);与各自相应的NC组比较,miR-16 inhibitor组miR-16的表达显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05),且A2aARmRNA和蛋白表达显著升高,并呈浓度依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论A2aAR为miR-16作用的靶基因之一,miR-16能负性调控A2aAR的表达。第三部分miR-16和A2aAR对炎症相关NF-κB信号通路的作用研究目的了解miR-16和A2aAR对炎症相关NF-κB信号通路的作用。方法用TNF～α刺激HT-29细胞建立炎症摸型;分别转染miR-16 mimics或miR-16 inhibitor 或共转染 miR-16 inhibitor+A2aAR-siRNA 及各自的 NC 至 TNF-α预先处理的HT-29细胞,应用western blot法检测胞浆、胞核中NF-κB p65蛋白的表达;qRT-PCR法检测IFN-γ和IL-8 mRNA的表达;ELISA方法检测IFN-γ和IL-8蛋白的表达。结果应用TNF-α刺激HT-29细胞后NF-κB p65蛋白从细胞浆转移至细胞核,且下游的炎症因子IFN-γ和IL-8表达增多。转染miR-16 mimics组与相应的NC组比较,胞浆NF-κB p65蛋白表达显著下降,胞核NF-κB p65蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且下游炎症因子IFN-γ和IL-8的mRNA和蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(iP<0.05);转染miR-16 inhibitor组与相应的NC组比较,胞浆NF-κB p65蛋白表达显著升高,胞核NF-κB p65蛋白表达显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05),且下游炎症因子IFN-γ和IL-8的mRNA和蛋白表达显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。共转染miR-16 inhibitor+A2aAR-siRNA 组与 miR-16 inhibitor+siRNA-NC 组比较,胞浆 NF-κB p65蛋白表达显著下降,胞核NF-κB p65蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),且下游炎症因子IFN-γ和IL-8mRNA和蛋白表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-16在炎症中可通过激活NF-κB信号通路发挥促炎的作用,并且可能部分通过调控A2aAR表达而实现。