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背景：再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是一种免疫介导的骨髓衰竭综合征,是血液科常见病、多发病及难治性疾病,其显著特点是骨髓造血衰竭。以往研究更多集中于造血干／祖细胞损伤机制方面,但因其数量显著减少、功能缺陷、体外不易扩增却容易分化等缺点限制此方面研究,目前处于相对停滞状态。寻找一种全新的研究方向势在必行。而再生障碍性贫血患者骨髓脂肪化、血管新生能力降低、骨皮质变薄等现象提示骨髓造血微环境同样存在缺陷。因此,研究骨髓造血微环境中各种细胞成分的前体细胞——骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)的生物学特性及其功能具有重要意义。目的：本研究旨在系统、全面地比较研究再生障碍性贫血患者BM-MSCs和正常人BM-MSCs生物学特性及功能的差异,为探讨再生障碍性贫血BM-MSCs损伤机制提供实验基础及理论依据,亦为再生障碍性贫血的发病机制研究探讨新思路。方法：(1)采用贴壁、传代培养的方法从AA患者和正常人骨髓组织中获取相对纯化的骨髓间充质干细胞；(2)倒置显微镜及共聚焦荧光显微镜观察骨架蛋白β-tubulin染色后BM-MSCs的形态变化；(3)流式细胞仪检测培养的BM-MSCs表面标志；(4)定向诱导BM-MSCs向脂肪细胞、内皮细胞和成骨细胞分化,进行相应染色及分化标志鉴定,比较成脂、成骨、成内皮的分化潜能；(5)测定BM-MSCs成纤维细胞样的集落形成能力(CFU-F)及增殖曲线；(6)流式细胞仪方法检测BM-MSCs细胞周期及细胞凋亡；(7)采用Affymetrix基因表达谱检测方法比较分析AA患者与正常BM-MSCs基因表达谱间的差异；(8)磁珠分选脐血来源的CD34＋细胞,建立BM-MSCs与CD34＋细胞共培养的二种培养体系(LTC assay和MK assay),比较研究AA患者和正常BM-MSCs扩增CD34＋细胞能力和促进造血克隆(CFU-G、CFU-M、CFU-GM、CFU-Mix、BFU-E和CFU-MK)形成的能力；同时比较了二种BM-MSCs表达造血生长因子(SCF、IL-3、EPO、TPO、IL-11、G-CSF、M-CSF和GM-CSF)的异同。(9)磁珠分选健康人外周血CD4＋细胞,同时采用贴壁法去除CD4-细胞中的贴壁细胞以获得相对高比例的CD4-淋巴细胞(大多数为CD8＋细胞),建立BM-MSCs与CD4+／CD4-细胞共培养体系,比较研究BM-MSCs对CD4+／CD4-细胞的克隆形成能力、增殖、分泌TNF-α和IFN-7的影响,以及BM-MSCs促进CD4＋细胞向Treg细胞分化能力。结果：(1)成功培养并获取高纯度的再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞；(2)AA患者BM-MSCs与正常BM-MSCs存在形态学差异,正常BM-MSCs细胞体积小纤细、呈长梭形,规则排列生长；AA患者BM-MSCs细胞体积较大,呈短梭形、多角形、不规则形,边缘不整齐,部分细胞见双核、多核。(3)AA患者BM-MSCs除了更高表达CD90外,其余表达标志CD73、CD105、CD90、CD44、CD29、CD49e、CD166以及MHC-Ⅰ类分子HLA-ABC无显著差别。二者均不表达造血细胞标志CD34、CD45及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。(4)AA患者BM-MSCs更易向脂肪细胞分化,但分化为内皮细胞和成骨细胞能力弱于正常BM-MSCs。(5)AA患者BM-MSCs形成CFU-F的能力和增殖能力明显弱于正常BM-MSCs。(6)AA患者和正常人BM-MSCs 90%以上均处于G0／G1期,但AA患者BM-MSCs细胞凋亡水平明显增加。(7)Affymetrix基因表达谱检测结果显示,AA患者和正常人BM-MSCs间存在差异表达的基因多达314个(Fold change≥2倍),涉及造血调控、免疫调节、细胞周期、细胞凋亡、细胞粘附、成脂分化等多方面基因。(8)与脐血来源的CD34＋细胞共培养结果显示,AA患者BM-MSCs扩增CD34+细胞能力和促进造血克隆形成能力(尤其支持长期造血能力和巨核细胞系造血能力)减弱。另外,二种BM-MSCs均不表达IL-3和EPO,AA患者BM-MSCs表达SCF、TPO、IL-11 mRNA水平低于正常者,而表达G-CSF和GM-CSF mRNA水平高于正常者,M-CSF差异不显著。(9)与外周血来源的CD4+／CD4-细胞共培养结果显示,AA患者BM-MSCs抑制CD4+／CD4细胞克隆形成、增殖和分泌TNF-a／IFN-γ的能力存在缺陷、促进CD4+细胞向Treg细胞分化能力减弱。结论：(1)再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞存在多方面、多层次的缺陷。(2)再生障碍性贫血患者BM-MSCs的多种生物学特性异常,包括形态异常、增殖和CFU-F形成能力减弱、多向分化能力异常(易成脂,不易向成骨细胞和内皮细胞方向分化)、细胞凋亡增加、基因表达谱异常。(3)再生障碍性贫血患者BM-MSCs通过分化为成骨细胞和内皮细胞构成HSC龛的能力减弱。(4)再生障碍性贫血患者BM-MSCs支持造血能力(尤其支持长期造血能力和巨核细胞系造血能力)减弱。(5)再生障碍性贫血患者BM-MSCs抑制CD4+／CD4-细胞增殖和分泌TNF-a／IFN-γ能力缺陷、促进CD4＋细胞向Treg细胞分化能力减弱。背景：再生障碍性贫血是一种免疫介导的骨髓衰竭性疾病,其发病机制涉及大量异常的免疫细胞和免疫分子。其中,IFN-γ,、TNF-α和多种白细胞介素(ILs)发挥着主要作用。IL-27是近年发现的一种IL-6／IL-12细胞因子家族成员,在机体内发挥着促进和抑制炎症的双重作用。IL-27可以诱导Th1细胞极化,促进淋巴细胞产生IFN-γ。然而,目前尚无IL-27在再生障碍性贫血发病机制中的相关报道。目的：本研究旨在检测再生障碍性贫血患者骨髓中IL-27及其受体的表达水平,探讨其在再生障碍性贫血发病机制中的作用。方法：(1)采用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(BMMNC):(2)Real-timePCR方法检测BMMNC中IL-27(p28和EBI3)及其受体(WSX-1／TCCR和gp130)mRNA表达水平；(3)流式细胞术检测IL-27刺激前后骨髓CD4+和CD8＋T淋巴细胞内IFN-γ、TNF-a的表达水平；(4)ELISA方法检测骨髓上清中IL-27、IFN-γ和TNF-a的水平以及IL-27刺激前后BMMNC培养上清中IFN-γ和TNF-a的水平变化。结果：(1)再生障碍性贫血患者骨髓BMMNC中IL-27(p28和EB13)和IL-27R的亚单位gp130 mRNA表达水平高于正常对照组(P<0.05),WSX-1／TCCR的表达水平虽然高于正常对照,但无统计学意义(P)>0.05)。(2)再生障碍性贫血患者骨髓上清中IL-27的浓度均高于正常对照(P<0.05),且与疾病的严重程度密切相关。(3)再生障碍性贫血患者骨髓上清中IFN-γ和TNF-a的浓度和CD4＋和CD8＋T淋巴细胞内IFN-γ和TNF-α的表达水平均高于正常对照,除了CD8＋T淋巴细胞内IFN--γ的表达水平无统计学意义外,其余均具有显著性差异(P<0.05)。(4)rhIL-27促进正常对照和再生障碍性贫血患者骨髓CD4＋和CD8＋T淋巴细胞产生更多的TNF-a和IFN-γ(P<0.05)。(5)rhIL-27促进再生障碍性贫血患者BMMNC产生更多的TNF-a和IFN-γ(P<0.05)。结论：再生障碍性贫血患者骨髓中增高的IL-27可能通过促进TNF-a和IFN-γ产生参与其发病机制。