感染红棕象甲的金龟子绿僵菌菌株筛选及致病力研究

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红棕象甲(Rhynchophorus ferrugineus Oliv.)属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae棕榈象属Rhynchophorus sp,英文名Red palm weevil。在我国危害15个属的19种棕榈植物,对红棕象甲进行有害生物风险分析结果显示其属于高风险有害生物,在我国很多地区极易定殖,对我国的棕榈科植物威胁巨大。应用金龟子绿僵菌来防治红棕象甲,为红棕象甲的综合防治开辟一条新的途径。为了揭示金龟子绿僵菌防治红棕象甲的致病过程、明确金龟子绿僵菌侵染红棕象甲的病理学变化、探索防控潜力奠定理论基础。研究结果如下:1.金龟子绿僵菌的分离鉴定通过从野外采集被感染红棕象甲僵虫身上分离出的14株菌株进行分离、纯化和鉴定得出:14株菌株的全部完整ITS1-5.8S-ITS2区域序列,全长均在600bp左右,提交NCBI上进行比对,其中13株均为金龟子绿僵菌小孢变种,但培养特性以及致病能力均有所不同,其中1株YX5菌株为金龟子绿僵菌属新变种,全数据库比对相似度仅为91%,所扩增的区域长度为685bp,将序列提交至GenBank,获得登录号为JN377427;依据14株菌株的序列,使用DNAMAN进行系统进化树分析,建立并分析了14菌株和绿僵菌其他种的系统进化关系。2.金龟子绿僵菌对红棕象甲4龄幼虫的生物测定在室内通过喷雾法评价了14株金龟子绿僵菌菌株对红棕象甲幼虫的致病力,初步进行筛选发现:不同菌株对红棕象甲4龄幼虫的致病力存在差异,其中以Red2、Red3和Gre1的致病力最高,处理后红棕象甲幼虫的死亡率均在90%左右,半致死时间LT50为5d,之后使用Red2、Red3和Gre1对4龄幼虫进行浓度梯度测定,得出:Red2菌株LC50为7.32×106个/mL,差异极显著高于Red3和Gre1菌株的10.60×106和11.24×106个/mL。以致病力最高的Red2为代表进行了水悬浮液和油悬浮液的2种悬浮液的比较发现:油悬浮剂的半致死时间明显缩短,但致死率和水悬浮剂差异性不显著,这在药剂的田间使用与施放上提供了一定参考,并根据金龟子绿僵菌的侵染周期设计了一种新型致病菌和信息素联用田间传菌装置。3金龟子绿僵菌侵染红棕象甲的组织病理研究通过对红棕象甲幼虫的冷冻切片观察,和对红棕象甲成虫的扫描电子显微镜的观察明确了金龟子绿僵菌侵染红棕象甲的基本过程:首先是通过接触红棕象甲,粘附于薄弱处,条件适宜正常萌发后长出菌丝,穿透寄主表皮感染体腔,并开始大量繁殖,直到寄主免疫系统崩溃死亡。红棕象甲成虫在接菌后24h内,金龟子绿僵菌开始萌发,在粘附处发出分生孢子梗、芽管等结构;48h即可见到菌丝的大量滋生,爬满表皮,在薄弱处侵入,冲破寄主表皮防御;72h金龟子绿僵菌的菌丝体已经感染内体气管、马氏管、脂肪、肌肉组织和头部器官,外部表皮可见到大量孢子体繁殖扩散,腿部跗节、气孔、毛窝和节间膜已经全部被菌丝体破坏充满。最后红棕象甲除坚硬的几丁质外壳,体内的营养物质被分解殆尽,体腔内全部被菌丝取代。
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