核仁磷酸蛋白在肺癌细胞染色体极化中的作用

来源 :苏州大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:Nathan_YM
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目的:随着我国社会、经济的发展,在人口老龄化加剧、饮食不合理、环境污染等因素影响下,恶性肿瘤早已成为严重影响中国人群健康的主要问题之一,并且日趋年轻化。据报道,我国恶性肿瘤的发病数、死亡数居高不下,每年有巨额的花费投入到恶性肿瘤的治疗上,给国家财政带来了极大的负担。2015年我国肺癌新发病例约有78.7万例,死亡人数约为63.1万例,肺癌不仅常年位居我国恶性肿瘤发病首位,也是导致我国死亡人数最多的恶性肿瘤。肺癌有多种分类方法,按照组织病理学分型主要分为非小细胞癌(NSCLC,约占85%)和小细胞癌(SCLC,约占15%)两大类。目前,肺癌的治疗手段主要有外科手术、放疗、化疗、免疫治疗、分子靶向治疗、中医治疗等,临床上推荐采用联合治疗。然而,尽管目前临床上这些治疗手段的普遍使用,肺癌,尤其是NSCLC的5年生存率仍然没有明显提高,依然保持在15~20%左右。因此,从肺癌的分子机制着手,寻找更有效的诊断及治疗靶点具有极其重要的意义。核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin,NPM)是一种核仁蛋白,它在核糖体生物合成、细胞凋亡、细胞周期、对应激刺激的反应等一系列细胞生存和增殖途径中发挥着重要作用。目前已经证实NPM和肿瘤的发生发展息息相关。NPM还与含CENP-A的核小体组装、细胞增殖等生物进程相关,前期实验结果也发现NPM可以抑制细胞增殖、增加细胞G2/M期阻滞,这些结果提示NPM可能成为提高肺癌治疗疗效的靶点之一。方法:本研究分为三个部分:(1)建立稳定细胞系。首先构建载体、病毒,并建立稳定细胞系,通过Western-blot方法检测稳定细胞系中NPM的表达,鉴定病毒工作效率。(2)NPM与辐射之间的关系。在本部分,我们利用Western-blot方法检测辐射后NPM的表达水平,以探究二者之间的关系。(3)NPM对细胞周期、细胞增殖及染色体极化等生物学效应的影响。利用CCK8和细胞克隆实验检测NPM对细胞增殖和克隆形成的影响;通过细胞周期实验探究NPM对细胞周期的作用;通过免疫荧光实验和Western-blot方法研究NPM和细胞染色体极化之间的关系。结果:首先,通过包装慢病毒建立敲低和过表达NPM的稳定细胞系,并通过Western-blot方法验证其工作效率,建立好的稳定细胞系用于后续实验。然后我们利用Western-blot方法验证辐射后肺癌细胞NPM蛋白的表达,结果显示细胞在照射后NPM的表达明显降低(p<0.05)。细胞增殖实验表明过表达NPM组A549细胞的增殖速度明显降低(p<0.05),敲低组变化不明显。我们用细胞克隆实验检测了各组细胞克隆形成情况,计算出细胞存活分数,并通过软件模拟细胞存活曲线,结果表明过表达NPM组的细胞克隆形成率明显降低(p<0.05)。我们用流式细胞仪检测了各组细胞在照射2 Gy后0、10、24小时的细胞周期分布,结果显示在接受2Gy X射线照射后10、24小时,过表达NPM组A549细胞发生G2/M期阻滞(p<0.05),并且在照射后10小时G2/M期细胞比例增多,24小时后G2/M期细胞比例未见下降(p<0.05)。通过检测A549细胞在施加辐射和过表达LNC CRYBG3后NPM的表达我们发现NPM与LNC CRYBG3和辐射之间存在一定的关系,X射线照射后NPM的表达有所下调(p<0.05);过表达LNC CRYBG3对NPM的表达没有明显影响;然而当同时施加X射线和过表达LNC CRYBG3的干预后,NPM的表达反而上升(p<0.05)。最后,我们用免疫荧光法检测中心体和tubulin蛋白以表征细胞分裂,实验结果表明,NPM可以增加细胞的非正常极化,导致基因组不稳定增加(p<0.05)。结论:过表达NPM可以导致肺癌细胞增殖减慢、存活率减低,并促进肺癌细胞X射线照射导致的G2/M期阻滞,通过与LNC CRYBG3的相互作用增加细胞异常极化的比例,导致肺癌细胞基因组不稳定,促进细胞的死亡。综上所述,本研究阐明了 NPM在肺癌辐射生物效应中的重要作用,可能为肺癌的治疗提供了新的策略。
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