胚胎的早期发育中，受精卵的正常分裂是胚胎发育的关键环节。受精卵在早期进行着旺盛的有丝分裂，其染色体能够正确分离到后代的两个子细胞中是有丝分裂正常的重要基础。染色体如果发生异常分离，有可能出现染色体数目异常、染色体不稳定性，进而影响细胞的生长周期，导致细胞周期的延迟甚至停止。为了确保分离的准确性，在真核生物细胞的整个分裂过程中，存在一个监护网络即纺锤体组装检查点，它对DNA的损伤、纺锤丝的完整性及染色体最终是否正常分离起着重要的监控作用。纺锤体组装检查点在行使检查点功能时关卡蛋白起了非常重要的作用，其中Bub1是其最主要的组件蛋白之一。它作为监控机制的“感受器蛋白”，对细胞的增殖、分化等过程的影响是可以肯定的。本课题组在前期实验中应用RNAi技术特异性抑制hBub1基因的表达，发现hBub1水平下调后导致胚胎细胞不同程度的染色体异常。同时对数十例自然流产胚胎组织的检测结果发现，hBub1基因表达的蛋白水平均明显低于正常或缺失。但在此过程中Bub1本身的表达是如何被调控的尚不清楚。新近发现microRNA（miRNA）是真核细胞中一大类参与基因转录后调控的非编码小分子RNA，与胚胎发育、干细胞分化等有关。本课题组已经证实在自然流产胚胎中Bub1蛋白表达水平明显低于正常组织中，而其mRNA水平却无明显变化，提示有可能存在miRNA这种转录后调控机制。通过生物信息学网上预测软件分析，miRNA-30a、30e、494、467a、467e、450a-3p、466a-3p和297b有可能调控Bub1蛋白。本课题将⑴利用重组腺病毒或者miRNA模拟体体外探讨Bub1蛋白是否确实存在转录后调控机制及其对小鼠成纤维细胞的增殖，凋亡和周期的影响。⑵通过受精卵显微注射过表达miRNAs下调Bub1表达观察对胚胎发育的影响。阐明miRNAs对胚胎细胞分裂的调控作用和相应机制，可为提高妊娠质量和防治胚胎异常流产提供思路。第一部分microRNAs与Bub1蛋白腺病毒过表达载体的构建和鉴定目的：1、构建miRNA-30a、30e、494、467a、467e、450a-3p、466a-3p和297b与Bub1蛋白腺病毒过表达载体。2、鉴定miRNA-30a、30e、494、467a、467e、450a-3p、466a-3p和297b腺病毒成功过表达成熟microRNA。3、鉴定Bub1蛋白腺病毒载体成功过表达Bub1蛋白。方法：1、采用巢式PCR方法从小鼠基因组中扩增miRNA基因（包含miRNA前体主要序列），亚克隆至穿梭质粒pSES-HUS，获得重组穿梭质粒pSES-miRNAs，经测序鉴定正确后酶切，电转入BJAdEasy感受态细胞中，与骨架质粒pAdEasy-1发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdSES-miRNAs，该质粒经Pac I酶切后在HEK293细胞中包装并扩增，最后经实时荧光定量PCR鉴定成熟miRNAs的表达；2、RT-PCR的方法从MEF细胞cDNA中扩增Bub1编码蛋白序列，亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4，获得重组穿梭质pAdTrace-TO4-Bub1。经测序鉴定正确后，酶切电转入BJAdEasy感受态细胞中，与骨架质粒pAdEasy-5发生同源重组，获得重组腺病毒质粒pAdEasy-TO4-Bub1，在HEK293细胞中包装并扩增，经FQ-PCR及蛋白印迹法western-blot鉴定重组腺病毒。结果：1、经测序鉴定，成功构建了重组穿梭质粒pSES-miRNAs和pAdTrace-TO4-Bub1。2、成功获得重组腺病毒质粒pAdSES-miRNAs和pAdEasy-TO4-Bub1，并顺利在HEK293细胞中包装，扩增。3、腺病毒Ad-miRNAs载体成功在细胞中转录和表达成熟miRNAs；腺病毒Ad-Bub1在细胞中成功转录和表达。结论：用pAdEasy系统成功的构建了Ad-miRNAs，Ad-Bub1腺病毒表达载体，它们不仅可以应用于本课题的后续研究，也可以应用在与miRNA和Bub1蛋白有关的其它研究中。第二部分microRNA-450a-3p靶向调控Bub1基因抑制小鼠胚胎成纤维细胞增殖的机制研究目的：1、从miRNA-30a、30e、494、467a、467e、450a-3p、466a-3p和297b中筛选出靶向调控Bub1基因的microRNA。2、在iMEFs细胞中过表达目的microRNA，检测Bub1蛋白的表达变化，并观察其对细胞增殖、周期、凋亡的影响。3、通过“rescue”实验策略，iMEFs细胞过表达目的microRNA后感染腺病毒Ad-Bub1表达载体，观察microRNA对细胞增殖、周期、凋亡等的影响是否出现逆转或者削弱现象。方法：1、通过生物信息学网上预测软件挑选出8个评分比较高的候选miRNAs。利用双荧光报告质粒实验筛选出可能靶向调控Bub1基因的目的miRNA，然后进一步通过mRNA水平（FQ-PCR方法）和蛋白水平（Western blot）去验证；2、昆明小鼠受孕后13.5天，取胚胎去头尾四肢内脏分离小鼠胚胎成纤维细胞，采用组织剪碎法和消化法原代培养MEFs细胞。进一步构建永生化小鼠胚胎成纤维细胞iMEFs细胞：逆转录病毒（携带SV40T基因）感染MEFs，抗生素筛选方法获得到iMEFs；3、CCK-8法检测细胞增殖情况，流式（FCM）检测对细胞周期的影响，Hoechst染色和流式（PEAnnexin V双染色）检测凋亡细胞比例，Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3和p-Caspase-3的表达变化。结果：1、成功筛选出miRNA-450a-3p能靶向调控Bub1基因，下调Bub1蛋白水平的表达，但Bub1基因mRNA水平无明显变化。2、成功培养了小鼠胚胎成纤维细胞，并将其永生化。3、CCK-8实验发现过表达miRNA-450a-3p组较对照组细胞增殖明显受到抑制，Hoechst染色和流式检测凋亡发现过表达组凋亡细胞增多，凋亡相关蛋白Caspase-3和p-Caspase-3的表达明显增加。4、FCM结果显示表达miRNA-450a-3p后G1期的细胞比例增加。5、“rescue”实验发现，当Bub1蛋白水平回升，细胞的增殖抑制减弱，凋亡细胞减少，周期阻滞消失。结论：miRNA-450a-3p能靶向结合Bub1基因的3’UTR区，在翻译水平抑制Bub1蛋白的表达，过表达miRNA-450a-3p后能抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡并将细胞阻滞在G1期，说明miRNA-450a-3p对细胞的生长和凋亡都产生了非常重要的作用，对后期进一步探索早期胚胎发育的研究提供了重要的理论基础。第三部分显微注射microRNA-450a-3p对小鼠早期胚胎发育的影响目的：1、掌握小鼠受精卵细胞（二细胞期）的获取和体外培养技术；2、显微注射miRNA-450a-3p-mimic后，观察对小鼠早期胚胎发育的影响及Bub1蛋白水平的变化。方法：1、采用PMSG和HCG对6周齢昆明小鼠雌鼠进行超排卵处理法，交配后（注射HCG后42h左右）处死老鼠，在解剖显微镜下通过输卵管的伞部端入针冲出二细胞期受精卵，M16培养基，37℃，5%CO2，饱和湿度的条件下进行体外培养；2、将获取的二细胞期受精卵进行体外培养，并分成三个不同处理组：空白组、显微注射control-mimic组和显微注射miR-450a-3p-mimic组，观察小鼠早期胚胎发育情况同时检测发育过程中Bub1蛋白水平的变化。结果：1、获得大量小鼠二细胞期受精卵并成功进行体外培养。2、小鼠受精卵显微注射miR-450a-3p-mimic后，与空白组和对照组相比，胚胎发育明显受到抑制，显微注射450a组仅37%左右的受精卵能成功发育到8细胞期，约34%左右的受精卵阻滞在二细胞期而死亡。而对照组和空白组结果相似，约57%左右的受精卵能成功发育到8细胞期，仅14%的受精卵阻滞在二细胞期而死亡。3、显微注射miR-450a-3p-mimic组受精卵细胞的Bub1蛋白水平较对照组和空白组明显下调。结论：显微注射miR-450a-3p-mimic能明显抑制小鼠的早期胚胎发育，其中下调Bub1蛋白的水平有可能是其发挥作用的一个重要原因。此部分实验为临床研究提供了新的研究思路，microRNA的进一步研究有望为预防自发性流产发现新的治疗靶点。