论文部分内容阅读
土壤酸化是全球粮食生产的主要环境限制因子，它影响着世界农业的生产和发展，同时也是导致大面积森林退化的重要因素之一。铝是地壳中含量最为丰富的金属元素，其通常以难溶性硅酸盐、长石、磷酸盐等形式存在，对植物并无毒害作用。但当pH降到5以下时，铝就会以离子形式释放出来，抑制植物根系伸长，成为酸性土壤影响植物生长发育的一个主要限制因素。所以铝毒害及植物耐铝机制的研究越来越引起科学家的广泛重视。植物遭受铝胁迫时，根际环境中大量的活性铝刺激植物体内的信号传递并产生一系列信号分子，激活相关控制基因，启动多种防御机制对铝胁迫作出响应和适应。基因芯片和蛋白组学的研究结果表明，铝胁迫不仅能影响植物基因的转录，也能影响相关蛋白的表达。因此，筛选耐铝相关的基因和蛋白有助于进一步深入了解植物的耐铝机制。本研究以拟南芥品种“哥伦比亚0”为实验材料，从拟南芥各组织中克隆得到MYB, NAC,C2H2等家族的130个拟南芥转录因子基因，运用In-Fusion克隆技术分别构建到转录表达载体pEGAD-3XHA-LUC中，形成35S::HA-LUC-CD融合基因，测序证明序列正确。以农杆菌介导的方法进行拟南芥蘸花侵染野生型“哥伦比亚4”，T1代用Basta进行抗性筛选，对阳性株系用luminometer酶标仪进行LUC荧光强度鉴定，每个基因至少获得2株融合蛋白表达的阳性株系。本筛选小组共筛选得到了71个拟南芥转基因材料。对实验室获得207份T2代转基因拟南芥材料进行耐铝基因的筛选，通过摸索实验条件，确定了胁迫液中Homopiperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonicacid)缓冲液和铝离子的浓度分别为0.5μM和50μM。将培养7d的幼苗用50μMAlCl3胁迫处理，使用luminometer酶标仪检测铝胁迫下融合蛋白的荧光表达强度,结果表明:共有15个蛋白表达量受铝诱导变化显著的基因，其中AT3G09150(HY2)等9个基因的蛋白表达量显著上调，AT1G74870.1等6个基因显著下调。对筛选获得的蛋白表达量变化显著的转基因拟南芥进行表型分析，发现HY2转基因拟南芥在铝胁迫下根伸长量显著高于野生型和pEGAD-3XHA-LUC空载转基因拟南芥，表现出了较强的耐铝性。当用镉、镧和低pH对拟南芥进行处理时，发现转基因拟南芥和野生型之间根长并无显著差异，说明HY2基因受铝专一性诱导。对HY2转基因苗进行DNA检测并测序，结果表明HY2基因已整合进拟南芥基因组中，luminometer蛋白表达量扫描证实35S::HA-LUC-CD融合蛋白得到表达。根尖铝含量测定和胼胝质染色实验表明HY2转基因拟南芥根尖铝含量和胼胝质含量均显著低于对照。综上表明，HY2基因参与铝抑制拟南芥根伸长生理过程的调节，为进一步阐明植物的抗铝机制提供新的实验证据。