Yin Yang 1（YY1）是一个重要的多功能转录因子,在多种实体肿瘤中高表达,在癌症的发生和发展中发挥着重要调节作用。随着近些年研究的深入,YY1作为肿瘤治疗靶点的潜质也渐渐得到了更多的关注与认同。一般情况下,在转录水平,YY1与带有其结合位点的启动子结合,招募p300,EZH2,HDACs等多种组蛋白修饰酶,通过调节染色质重构进而调控基因表达。在蛋白水平,YY1通过位于氨基酸201-226之间的OPB（oncoprotein binding）区域结合MDM2,促进其介导的p53泛素化降解;也通过OPB区域结合AKT,并促进其通过S473位点磷酸化的激活。近几年,YY1二聚体的形成被相继报道,YY1的二聚体能够促使染色质成环,拉进相隔较远的增强子与启动子来调控基因表达。这些发现提出了YY1调节基因表达的新模式。本论文针对YY1二聚体形成的分子机理进行了创新性探索,主要研究结果包括:1.鉴定YY1蛋白负责分子间相互作用的区域:首先,将YY1野生型（wt）及其截短突变体的重组蛋白进行原核表达与纯化,通过体外蛋白质互作实验,初步确定了负责YY1分子间相互作用的区域主要集中在YY1蛋白的中后段。然后,利用表面等离子共振（surface plasmon resonance,SPR）技术确定了YY1的OPB区域和锌指（zinc finger,ZF）区域参与了YY1分子间相互作用。2.确定YY1分子间相互作用的结合模式:构建了带有不同标签的YY1（wt）及其截短突变体的真核表达载体,利用细胞转染及免疫共沉淀方法,确定了同源区域间的相互结合是YY1单体间相互作用的主要模式。由于ZF区域负责与DNA结合,并在介导蛋白间相互作用中存在非特异性,因此,OPB区域负责YY1分子间的特异结合。在以下实验中,主要利用YY1（ΔZF）研究其分子间相互作用。3.鉴定YY1具有形成寡聚体的分子特性:在评价带有OPB肽段的融合蛋白如何影响YY1分子间相互作用的免疫共沉淀实验中,OPB肽段的增加促进了YY1（ΔZF）二聚体或多聚体的形成。与此相符,在体外实验中,化学合成的OPB肽段也能够促进重组YY1（ΔZF）在非变性聚丙烯凝胶电泳中形成高分子量的寡聚体。4.鉴定决定YY1寡聚体形成的关键性氨基酸:首先,利用SWISS-MODEL,ZDOCK和COOT等分子模型运算法则对OPB区域进行双分子的对接模拟,预测OPB分子间相互作用可能受到8个疏水性氨基酸残基的调节。根据两个拟合度最高的模拟构象进行了疏水性侧链的对接分析,选出了包括I212,L215和F219三个可能影响YY1分子间聚合的疏水性氨基酸。构建了四个YY1（ΔZF）突变体I212A,L215A,F219A和3A（即三个疏水性氨基酸同时突变的突变体）。利用免疫共沉淀的方法,确定了OPB区域的F219在YY1寡聚体形成中发挥了决定作用。5.揭示了YY1寡聚体形成对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响:在乳腺癌MDA-MB-231,MDA-MB-453和MCF-7细胞中,利用靶向于YY1 m RNA 3’-UTR的sh RNA敲低内源YY1,然后,通过慢病毒侵染,在这些细胞内稳定表达YY1野生型（wt）及突变体,并检测所获得的细胞的增殖及迁移能力。结果表明,失去寡聚能力的YY1（F219A）和YY1（3A）突变体显示出比YY1（wt）更强的促进乳腺癌细胞增殖和迁移的能力。6.探究失去寡聚能力的YY1突变体比YY1（wt）有更强促增殖能力的分子机制:根据以往报道,YY1的OPB区域能够结合癌蛋白EZH2,AKT和MDM2并促进他们的活性。在免疫共沉淀实验中,与YY1（wt）相比,YY1（F219A）和YY1（3A）与EZH2和AKT结合能力增强,但与MDM2结合能力减弱。因此,我们推测,YY1寡聚化能力的丧失,使得细胞内单体YY1的数量增多,因而也增加了YY1与EZH2和AKT的结合机会,进而促进了这两个癌蛋白所调控的促癌信号通路,增强了乳腺癌细胞的增殖和迁移能力。综上所述,本研究首先鉴定了OPB区域是促进YY1分子间相互作用的主要区域。进而发现疏水性氨基酸F219为该区域中决定YY1聚合体形成的关键性氨基酸,并进一步揭示了YY1寡聚体的形成与YY1对EZH2和AKT等癌蛋白的结合及调控存在的竞争关系。这项研究为深入了解YY1在染色质层面的转录调节机制提供了直接的实验依据,同时也为YY1可以作为肿瘤治疗的新靶点提供了新的理论依据。