【摘 要】
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子宫腺体及其分泌物对雌性哺乳动物子宫接受态的建立、胚胎的植入和后续的发育都至关重要。大部分哺乳动物的雌性幼崽出生时子宫内只有一层腔上皮而没有腺体。在出生后的短时间内,部分子宫腔上皮细胞增殖、分化、并向子宫基质内迁移,最终形成复管状的子宫腺体,称为子宫腺体发生。很多研究表明,敲除某些特定的基因会导致腺体发生障碍从而引起妊娠失败。但是很多关于腺体发生的深层机制的问题都没有解决。例如,哪些基因对腺体的发
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子宫腺体及其分泌物对雌性哺乳动物子宫接受态的建立、胚胎的植入和后续的发育都至关重要。大部分哺乳动物的雌性幼崽出生时子宫内只有一层腔上皮而没有腺体。在出生后的短时间内,部分子宫腔上皮细胞增殖、分化、并向子宫基质内迁移,最终形成复管状的子宫腺体,称为子宫腺体发生。很多研究表明,敲除某些特定的基因会导致腺体发生障碍从而引起妊娠失败。但是很多关于腺体发生的深层机制的问题都没有解决。例如,哪些基因对腺体的发生至关重要?腺体是由哪些细胞发育而来,是一个细胞发育成一个腺体还是某些细胞共同发育成腺体?为了解决这些有关腺体发生的机制问题,我们需要一种诱导型新生鼠子宫上皮特异性的基因操作工具,以便在子宫腺体发生的关键时间点对感兴趣的基因进行敲除、敲入,以及对腺体发生过程的细胞谱系追踪等本实验室现有子宫腔上皮和腺上皮特异性表达的基因工程鼠Ltf Cre/+,但是这种基因工程鼠并不是可诱导型,而且只能在成年鼠的子宫上皮中而不是在初生鼠子宫上皮中介导基因的敲除和敲入。在本研究中,我们希望通过技术改造使该基因工程鼠具备可诱导性并能够在初生鼠中使用。开发新的技术使得Rosa26-m Tm G和Rosa26-Brainbow等报告基因能在仔鼠腺体发生前瞬时激活和关闭,以便可以通过荧光表达情况追踪腺体发生过程中的细胞图谱。本研究采用了皮下注射雌激素诱导Ltf-Cre表达的方法和子宫腔注射表达Cre重组酶腺病毒的方法尝试在初生鼠子宫上皮中激活Cre-Loxp系统。在雌激素诱导方法中,首先用野生型C57小鼠做预实验,即在PND2～4（Postnatal day）连续三天皮下注射雌激素,观察雌激素本身是否会影响腺体发育,结果证明至少在PND15天时,皮下注射雌激素的小鼠子宫及子宫腺体发育在形态上与正常鼠没有明显区别没有。PND2～4连续三天注射剂量分别为20 ng/只,100 ng/只,200 ng/只,400 ng/只的雌激素,都未能在PND7或PND10未观察到Cre-Loxp系统被提前激活的现象。分析主要原因可能是在PND2～5仔鼠子宫腔上皮的雌激素受体α（Estrogen receptorα,ERα）的表达量比较低,不能介导雌激素激活乳铁蛋白（Lactotransferrin,Ltf）的启动子,进而激活Cre酶。在子宫腔注射表达Cre重组酶的腺病毒的方法中,基因型为Rosa26brainbow/brainbow的PND7的仔鼠从腹部侧方开口,找到子宫,注2μL滴度为1×l010PFU/m L的表达Cre重组酶的腺病毒,于PND9、11、13、15、17和30取材观察子宫上皮荧光表达情况,结果均未发现荧光。但是,将同样的腺病毒注入妊娠第4天小鼠子宫腔内,可以在第8天观察到很强的荧光表达,说明新生仔鼠子宫腔上皮细胞可能不具备被腺病毒感染的条件。本研究尝试通过开发仔鼠子宫上皮特异性可诱导的Cre-Loxp系统的技术,为日后子宫腺体发育的研究提供一个有力的工具,通过特异性的基因敲除与敲入,结合Rosa26-Brainbow基因工程鼠进行子宫腺体发育的谱系追踪,深入研究子宫腺体发育的生理过程。虽然技术开发并未取得成功,但本研究还是在该技术的开发上取得了一定的进展,为进一步的技术开发奠定了基础。
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