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研究目的从体外实验的角度,研究犀角地黄汤对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,以及与炎症反应相关的TLR4/MyD88信号通路在犀角地黄汤神经保护效应中的作用。通过本课题的研究,以期深化中医瘀热理论在缺血性卒中治疗中的指导意义,并为缺血性卒中的治疗提供新的策略。研究方法首先,本课题采用高效液相色谱法(HPLC)同时测定犀角地黄汤中主要成分芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷的含量,建立犀角地黄汤的质量控制分析方法。其次,本研究以PC12细胞为研究载体,在体外通过氧糖剥夺和复氧方法模拟脑缺血再灌注损伤。实验中将PC12细胞分为空白对照组(control)、模型对照组(OGD/R)、犀角地黄汤组(XJDH)和芍药苷组(Paeoniflorin)。空白对照组细胞正常培养,不经过OGD/R处理;模型对照组细胞经OGD/R处理,但不加任何药物干预;犀角地黄汤组是加入犀角地黄汤干预,在CGD/R条件下培养细胞;芍药苷组是加入犀角地黄汤的活性成分芍药苷,在OGD/R条件下培养细胞。药物与细胞孵育一定时间后,通过MTT实验及LDH释放实验,考察犀角地黄汤或芍药苷对细胞活力的影响;ELISA法测定各组细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放水平,并检测细胞内caspase-3的浓度,考察犀角地黄汤或芍药苷神经保护作用与炎症、凋亡的关系。通过Western Blot实验,研究犀角地黄汤或芍药苷对TLR4、MyD88、NF-κB、TRAF6、p-ERK、p-JNK、Akt和cleaved caspase-3等蛋白表达水平的影响,初步探讨犀角地黄汤神经保护作用的可能机制。研究结果HPLC实验结果显示,犀角地黄汤中芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苻三种物质的含量分别为0.232±0.031%、0.276±0.018%、0.019±0.002%。所建的分析方法操作简便快速准确,可为犀角地黄汤的质量控制提供依据。氧葡萄糖剥夺复氧后,与正常培养PC12细胞相比,OGD后PC12细胞活性下降43.75±2.4%。提前给予0.4,0.2,0.1 mg/mL犀角地黄汤处理,细胞活力分别为91.9 ± 2.6%,97.3 ± 3.5%,66.9 ± 1.8%,与模型对照组比较均具有显著性差异。LDH检测实验结果表明,犀角地黄汤可以减少细胞内LDH的释放,改善OGD/R导致的PC12细胞损伤。ELISA实验数据表明,OGD/R能够促进炎症介质1L-1β、1L-6和TNF-α的产生,而犀角地黄汤和芍药苷均可显著抑制相关炎症介质的释放。进一步机制研究表明,犀角地黄汤和芍药苷上调PC12细胞中TLR4,MyD88,TRAF6和NF-κB表达,降低细胞caspase-3含量,上调cleaved caspase-3水平,对MAPK和Akt相关通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK没有显著性影响。研究结论(1)犀角地黄汤能够减轻OGD/R对PC12细胞的损伤,起到神经保护作用;(2)犀角地黄汤通过调控TLR4/MyD88通路,降低炎症因子释放,起到神经保护作用;(3)中医瘀热理论在缺血性卒中的研究中具有重要价值,而犀角地黄汤有望为缺血性卒中提供新的治疗方法。