松材线虫病(Pine wilt disease)又称松树萎蔫病或松树枯萎病,是松树的一种毁灭性病害。目前已知分布于中国、日本、韩国、美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、西班牙等国家。我国自上世纪80年代初首次发现该病以来,病情扩散蔓延迅速,已对我国的松林生态系统构成了严重的破坏和威胁,成为我国最危险的森林有害生物之一。该病害的发生涉及寄主树种、传播媒介、松材线虫及其携带的微生物、以及环境因素等多个方面,至今其致病机理尚存争议。若要进一步深入揭示松材线虫病的致病机理,最直接、最有效的方法就是获取松材线虫致病过程中的关键基因信息,并对其进行功能分析。目前国际上已公认植物寄生线虫食道腺细胞分泌物在植物线虫与寄主互作过程早期起到关键作用,因此编码这类分泌物的基因被认为是线虫的致病相关基因。其中,在食道腺细胞特异表达的类毒液过敏原蛋白基因(Bx-vap-1)已成功在松材线虫中克隆分离,推测该基因在松材线虫寄生寄主的早期阶段发挥了重要作用,很可能是松材线虫的致病基因。本研究即以Bx-vap-1基因为研究对象,采用正向验证基因功能的方法,将Bx-vap-1基因在昆虫细胞中表达获得重组VAP蛋白,用来模拟松材线虫口腔分泌物,接种三年生马尾松,检测不同时期寄主松树防御基因的表达、萜烯含量的变化以及组织病理学变化,意从分子防御水平、生理代谢水平和组织病理学水平上的寄主响应事件来分析Bx-vap-1基因的功能,从而为松材线虫病致病机理研究提供理论基础。主要结论如下：1.利用Bac-to-Bac表达系统原理,将松材线虫Bx-vap-1基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA,将重组质粒pFastBac-vap转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,细胞内发生转座,获得重组杆状病毒表达载体Bacmid-vap。在脂质体的介导下,转染Sf9昆虫细胞,病毒扩增3代后收获重组VAP蛋白,经SDS-PAGE和Western Blot检测验证了目的蛋白的特异性。通过对P2代杆状病毒转染细胞的M.O.I值和转染时间进行优化,最终实现了目的蛋白的大量表达。2.利用RACE技术分离克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因全长,并结合生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的特性。马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列共1890bp,编码629个氨基酸。编码蛋白的预测分子量为71.94kDa。α-蒎烯合成酶基因编码蛋白含有1个金属结合结构域、一个天冬氨酸富集基序(DDMYD),符合单萜烯合成酶基因的典型特征。序列提交至GeneBank,获得登录号KF547035。该基因的分离克隆为研究马尾松分子防御机制提供了基因信息。3.将重组VAP蛋白作为接种体,模拟松材线虫口腔分泌物,接种三年生马尾松,接种试验表明重组VAP蛋白可以诱导马尾松α-蒎烯合成酶基因上调表达和α-蒎烯含量增加,这表明在松材线虫与松树互作过程中,线虫口腔分泌的VAP蛋白可作为激发子启动寄主的防御反应,因此编码VAP蛋白的Bx-vap-1基因是松材线虫的致病基因。4.重组VAP蛋白接种三年生马尾松,接种点附近表现出明显的感病症状,针叶干枯下垂,韧皮部坏死,木质部髓心组织褐变。细胞学观察发现VAP蛋白可以诱导马尾松细胞发生质壁分离、细胞核降解等现象,属于典型的细胞程序化死亡,说明VAP蛋白对寄主细胞有毒害作用,再次验证了Bx-vap-1基因是松材线虫的致病基因。但接种VAP蛋白没有引起马尾松的空洞化现象,空洞的形成可能还需要如细胞壁降解酶等其它致病因素的共同作用。