论文部分内容阅读
目的：构建具有干扰效应的靶向Survivin和CDK1基因及两者串联的短发夹样RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达载体,并研究其对鼻咽癌细胞CNE-2干扰后,癌细胞的生物学行为(增殖、凋亡)的改变。方法：根据Genbank记录的Survivin及CDK1序列,遵循shRNA设计原则并合成相应的寡核苷酸链SurvivinshRNA、 CDK1shRNA’构建pU6-SurvivinshRNA、 pU6-CDK1shRNA重组载体,用脂质体Lipofectamine2000方法将其转染入CNE-2细胞株中,RT-PCR初步筛选具有干扰效应的pU6-SurvivinshRNA、 pU6-CDK1shRNA;将上述具有干扰效应的SurvivinshRNA和CDK1shRNA串联进行pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA表达载体的构建,经酶切及测序鉴定后,以脂质体Lipofectamine2000转染CNE-2细胞株后；收集转染单基因及联合基因重组质粒的CNE-2细胞,进行逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测癌细胞Survivin和CDK1的mRNA表达水平,Western blot检测Survivin和CDK1蛋白表达的变化,噻唑蓝溴化四唑(]methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测癌细胞增殖活性的变化,流式细胞仪检测癌细胞凋亡的变化。结果：(1)经酶切及测序结果分析：pU6-SurvivinshRNA、pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体均成功构建；(2)RT-qPCR的结果显示：pU6-SurvivinshRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA各干扰组均下调Survivin mRNA的表达,分别为52.7%和82.4%,pU6-CDK1shRNA干扰组的Survivin mRNA的表达没有下调；pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1ShRNA各干扰组均下调CDK1mRNA的表达,分别为56.7%和85.0%, pU6-SurvivinshRNA干扰组的CDK1mRNA的表达没有下调；(3) pU6-SurvivinshRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均下调Survivin蛋白的表达,pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均下调CDK1蛋白的表达。(4)MTT法检测癌细胞增殖活性的结果显示：pU6-Survivin,hRNA、 PU6-CDKlshRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均能抑制细胞的生长,抑制率分别为25.60%、15.62%和32.54%；(5)流式细胞仪检测癌细胞凋亡的结果显示：pU6-SurvivinshRNA、 pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA干扰组均促进癌细胞凋亡,凋亡率分别为10.27%,8.00%和14.87%。结论：(1)pU6-SurvivinshRNA、 pU6-CDK1shRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体均成功构建；(2) pU6-SurvivinShRNA、pU6-CDK1ShRNA和pU6-SurvivinshRNA-CDK1shRNA重组载体干扰鼻咽癌细胞,均可以抑制癌细胞的增殖,促进癌细胞的凋亡；(3)Survivin基因和CDK1基因有望成为鼻咽癌肿瘤基因治疗的靶基因,多基因联合干扰可以提高效应。