论文部分内容阅读
背景：我国是肝病大国,慢性乙型肝炎患者数量占全世界的三分之一,慢性乙肝所引起的肝硬化甚至肝癌严重威胁患者的健康。纤维化是慢性肝病一个共同的病理过程,具有可逆性,我们可以通过研究肝纤维化的发生机制,寻求有效的药物阻止肝纤维化的进展,从而减缓慢性肝病发展为肝硬化的进程。肝纤维化的研究较多,普遍肝星形细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化是肝纤维化的中心事件,活化后的HSC产生大量的细胞外基质(extracellular matrix, ECM),而基质金属蛋白酶分泌不足及其抑制剂分泌过多,过多的细胞外基质沉积在肝脏而形成的一个病理过程。早期HSC的活化主要是由肝中kupffer细胞、肝窦内皮细胞、血小板等分泌各种细胞因子和生长因子引起,后期的持续活化则主要是由活化的HSC自分泌各种生长因子维持,活化后的HSC源源不断地产生ECM,促进纤维化的进一步发展,其中重要的生长因子有转化生长因子β1(transforming growth factor beta, TGF-β1、血小板源性生长因子(Platelet-derived growth factor, PDGF)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)等。在肝纤维化中,肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,SEC)的作用也受到越来越多的重视。SEC是肝窦壁的主要细胞成分,SEC是一种特殊的血管内皮细胞,形态与功能都与普通的血管内皮细胞有较大的差别,首先SEC胞质上有排列成筛状的窗孔结构,有利于肝细胞和血窦中各种成分进行交换。其次肝窦是一种不连续的毛细血管,内皮下没有基底膜的存在,仅有少量纤维结缔组织,SEC也不表达普通血管内皮细胞的标志物,它有自身独特的标志物如CD4和CD14等。肝纤维化时,肝窦内皮细胞发生毛细血管化,即失去窗孔结构,并有内皮下连续性基底膜的形成,此时表型也发生较大的改变,失去自身的标志物并开始表达普通血管内皮的标志物,如第Ⅷ因子相关抗原(Von Willebrand factor, vWF)、CD31和CD34等。目前,肝纤维化没有特效的治疗药物,我国中药及其复方因副作用小、多途径、多靶点作用等特点,在肝纤维化治疗中取得了较好的效果。扶正化瘀方(又称319方)由丹参、虫草菌丝、桃仁、绞股蓝、五味子、松花粉组成,针对肝纤维化“瘀血阻络、正气虚弱”的基本中医病因研制而成,有研究表明其具有保护肝细胞、抗脂质过氧化、抑制促肝纤维化细胞因子生成、抑制肝星形细胞增殖活化和胶原生成等作用。本实验以肝星形细胞和肝窦内皮细胞为出发点,研究扶正化瘀方抗肝纤维化的作用机制,为其临床应用提供进一步的实验依据。IFN-γ和β-雌激素是研究较多的抗纤维化药物,研究表明均具有良好的抗纤维化作用,本实验γ-干扰素和β-雌二醇作为阳性对照药物。目的：探讨扶正化瘀方对肝星形细胞和肝窦内皮细胞功能的影响,从细胞水平证实扶正化瘀方的抗纤维化作用。方法：扶正化瘀方药物粉末以0.46g/10ml的容积配制成悬液,以0.46g/kg大鼠体重的剂量灌胃SD大鼠,采取二次重复给药方式,即第一次灌胃2小时后再次灌胃,第二次灌胃后1小时心脏采血,并离心全血提取药物血清,对照组是在相同条件下灌胃三蒸水并提取对照组血清,将两组血清以10%的浓度分别配制成的扶正化瘀方药物组培基(简称319组)和对照组培基。同时在对照组培基中分别加入γ-干扰素、β-雌二醇作为阳性对照药物培基,四组培基分别作用于HSC和SEC48小时,用下列方法检测药物对两种细胞的影响：1.免疫细胞化学方法检测HSC表达a-SMA、Desmin的情况；2.Western blot方法检测HSC表达a-SMA、Desmin. TGF-β1, CTGF蛋白的情况；3.流式细胞术检测HSC的增殖活性；4.免疫细胞化学和Western blot方法共同检测SEC vWF、CD31的表达情况；5.扫描电镜观察SEC表面窗孔结构的改变。结果：1.免疫细胞化学结果显示319组HSC表达a-SMA、Desmin均较对照组明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05),而319组、γ-干扰素组和β-雌二醇组组间差异没有统计学意义(P>0.05)；2.Western blot结果显示319组HSC α-SMA、 desmin、 TGF-β1、 CTGF蛋白的表达均较对照组明显下调,差异具有统计学意义(P<0.05),而319组、γ-干扰素组和β-雌二醇组组间差异没有统计学意义(P>0.05)；3.流式细胞术显示319组HSC增殖活力较对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而319组、γ-干扰素组和β-雌二醇组组间差异没有统计学意义(P>0.05)；4.免疫细胞化学和Western blot结果显示319组SEC vWF、CD31蛋白的表达均较对照组表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05),而319组、γ-干扰素组及β-雌二醇组组间差异没有统计学意义(P>0.05)；5.扫描电镜显示对照组SEC大部分窗孔处于闭塞甚至消失状态,而经扶正化瘀方治疗后SEC表面窗孔的明显增多。结论：1.扶正化瘀方可以下调活化的肝星形细胞a-SMA、 Desmin、 CTGF、 TGF-β1的表达和降低其增殖活性。2.扶正化瘀方可以下调肝窦内皮细胞vWF、CD31的表达,及增加细胞表面的窗孔结构,从而逆转肝窦的毛细血管化。3.扶正化瘀方可能是通过下调HSC分泌ECM和抑制HSC增殖及逆转肝窦的毛细血管化发挥抗纤维化作用。