论文部分内容阅读
从芒果的叶和茎的组织中分离并鉴定得到解淀粉芽孢杆菌MG-3,该菌株能够分泌多种抑制果蔬病害真菌的活性物质。本文对解淀粉芽孢杆菌MG-3分泌抗菌蛋白的分离纯化及其性质进行研究。本实验将解淀粉芽孢杆菌MG-3培养得到发酵液,先采用硫酸铵分级沉淀法,按20%,40%,60%的硫酸铵饱和度分离浓缩粗蛋白,再采用DEAE-650C弱阴离子交换层析和Sephacry1 S-200凝胶层析的技术组合策略,分离纯化粗蛋白。以枇杷焦腐病菌为供试菌株,验证抗菌蛋白的抗菌活性;并用SDS-PAGE电泳分析抗菌蛋白为单一组分,分子量大约45KDa。利用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定抗菌蛋白,结果表明抗菌蛋白很可能是丝氨酸蛋白酶,分子量大约48147.1Da。对纯化到的抗菌蛋白进行稳定性研究,实验结果表明抗菌蛋白具有良好的稳定活性,无论温度,pH,紫外线等处理条件怎么变化,抗菌蛋白的相对活性都维持在70%以上。其中蛋白酶K对抗菌蛋白的活性几乎没有影响;抗菌蛋白100℃处理30min后,仍能保持70%相对活性。研究测定抗菌蛋白浓度对枇杷焦腐病抑制效果的影响,抗菌蛋白对病害菌的作用方式及抗菌蛋白的广谱性。实验结果表明:半数抑菌浓度(IC50)是40.58ug/mL,最小抑菌率(MIC)是80.60ug/mL及最小杀菌率(MBC)是119.8ug/mL;抗菌蛋白不仅能够降解病害真菌的菌丝,也能抑制病害菌的分生孢子的萌发;抗菌蛋白能够抑制枇杷焦腐病菌,枇杷炭疽病菌,橄榄焦腐病菌,荔枝焦腐病菌等多种果蔬病害真菌,具有良好的广谱性;还能保护枇杷,延迟枇杷的存储时间。根据抗菌蛋白的质谱的鉴定结果和NCBI数据库比对分析,设计带有酶切位点引物,以解淀粉芽孢杆菌MG-3的基因组作为模板,PCR扩增目的片段基因,将目的片段基因与PMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌,测序。将含有目的片段基因的T载体与PET-28a的载体双酶切,再将目的片段与酶切的PET-28a载体连接,构建成表达载体,转化到大肠杆菌中。用IPTG诱导目的片段基因在大肠杆菌表达,离心,破碎菌体,采用镍柱层析法纯化重组蛋白,同样以枇杷焦腐病菌作为供试菌株,验证重组蛋白的抗菌活性。