研究背景：黏着斑(focal adhesion)是一个以整合素(integrin)为中心的蛋白分子复合体，整合素的胞内段与肌动蛋白细胞骨架(微丝)接合，胞外段与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)结合，从而实现细胞和细胞外基质的相互黏附，并参与信号胞内转导，调节细胞迁移、增殖、分化、死亡和基因表达。整合素胞内段与肌动蛋白(actin)的接合必需借助于一系列蛋白，这些蛋白被称为黏着斑相关蛋白。DLC(Deleted in liver cancer)蛋白亚家族即属于黏着斑相关蛋白。DLC目前有三个成员：DLC1、DLC2和DLC3，它们具有相似的蛋白结构：由SAM功能域、RhoGAP功能域和START功能域组成。DLC含有RhoGAP功能域，因而也属于Rho GTP酶激活蛋白家族(Rho GAPs)，这些蛋白的主要功能与其RhoGTP酶蛋白(RhoGAP)活性有关。DLC1是DLC第一个成员，对它的研究也最全面。DLC1是在对肝癌染色体缺失片段的研究中被发现并克隆的。DLC1被认为属于抑癌基因，与多种肿瘤的发生、发展有关。DLC1参与调节细胞形态、黏附、迁移、增殖和死亡。在DLC1缺失的细胞中重表达DLC1可有效的抑制细胞生长。DLC1基因敲除小鼠胚胎在10.5dpe(dayspost coitum)后不能存活。DLC2，别名STARD13，于2003年被成功克隆，它与DLC1有相似的蛋白结构，也在多种肿瘤中表达下调，亦可通过其RhoGAP结构域抑制肿瘤细胞的生长，因而也被认为是一个潜在的抑癌基因。但是，DLC2在功能上是否与DLC1有不同，是否是一个冗余基因，我们尚无答案。目前对于DLC2的研究尚处起步阶段，尚未建立DLC2表达谱，对DLC2的潜在抑癌作用机制和其它生理学功能的了解也非常贫乏。　　 研究内容：在本研究中，我们拟对DLC2的基本生物学特征进行较全面的研究，包括建立DLC2基因敲除小鼠模型；借助基因报告-敲除系统，描绘小鼠体内DLC2的表达谱，同时研究DLC2基因缺失后对小鼠体内血管生成等的影响。此外，我们还要在上述研究结果的基础上进一步研究DLC2在内皮细胞中的功能以及它与血管生成之间的关系，并探讨了DLC2调控血管生成的机制，为明确DLC2的生理学功能和抑癌作用机制，以及将DLC2应用于抗肿瘤治疗的靶点奠定了理论基础。　　 本研究分为四个部分：　　 第一章 DLC2基因结构、序列特征和表达特点。　　 目的：了解DLC2的基本生物学特征和表达情况。　　 方法：⑴通过生物信息学方法分析DLC2基因结构和分子序列的特征；⑵采用实时定量PCR在mRNA水平检测小鼠各个组织器官中DLC2的表达情况；⑶采用实时定量PCR在mRNA水平检测人恶性肿瘤eDNA样本(肾癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌和食管癌)中DLC2的表达情况；⑷制备特异性抗DLC2抗体，在蛋白水平检测结肠癌、乳腺癌和前列腺癌细胞系中DLC2的表达情况；⑸构建GFP-DLC2融合蛋白，研究DLC2的亚细胞定位。　　 结果及结论：①DLC2属于Rho GTPase-activating proteins(GAPs)家族成员，它的蛋白分子结构中包括SAM、RhoGAP和START三个结构域，DLC2的生理学功能可能与RhoGAP结构域活性密切相关；②DLC2在小鼠肺组织中有较高转录水平，在脾和骨骼肌中无表达；③DLC2在人乳腺癌和前列腺癌中表达下调，提示DLC2可能作为抑癌基因参与乳腺癌和前列腺癌的发生、发展过程；④DLC2通过N端定位于黏着斑，包括SAM结构域、FAT结构序列，但具体负责结合的部位和酪氨酸位点尚需进一步研究。　　 第二章 DLC2基因敲除小鼠模型的建立和DLC2组织分布特点。　　 目的：建立DLC2基因敲除小鼠模型，观察DLC2缺失表型及DLC2表达特征，从中推测DLC2的生理学功能。　　 方法：⑴在小鼠胚胎干细胞中通过同源重组的原理用敲除靶载体取代内源DLC2基因，建立DLC2基因敲除小鼠模型；⑵采用PCR方法分析小鼠基因型并观察DLC2基因敲除小鼠的表型；⑶采用免疫沉淀方法确定DLC2在基因敲除小鼠模型中完全缺失；⑷采用X-Gal染色检测DLC2在小鼠各个组织器官中的原位表达情况；⑸采用连续切片X-gal、CD31免疫组织化学染色确定DLC2在血管中的表达定位。　　 结果及结论：①DLC2基因报告-敲除小鼠模型构建成功；②DLC2基因敲除小鼠可正常发育、成年和繁殖，未发现异常表型，提示DLC2对小鼠的生长发育繁殖可能不是必需的；③DLC2在小鼠肺、肝等组织高表达；④DLC2在小鼠内皮细胞中高表达，提示DLC2可能参与血管生成反应过程。　　 第三章 DLC2与血管生成关系的观察。　　 目的：利用DLC2基因敲除小鼠模型，观察DLC2与血管生成的关系，探讨DLC2在小鼠内皮细胞中高表达的生理学意义。　　 方法：⑴通过基质胶血管生成诱导实验和动脉环种植实验，观察DLC2缺失对内皮细胞迁移和血管生成的作用；⑵通过小鼠皮肤创伤实验观察DLC2缺失对创伤诱导的血管生成的作用；⑶建立B16肿瘤移植模型，观察DLC2缺失对肿瘤诱导的血管生成的作用。　　 结果及结论：DLC2基因敲除小鼠对基质胶和肿瘤细胞诱导的血管生成反应较野生型小鼠强，但是DLC2基因敲除小鼠对创伤诱导的血管生成与野生型小鼠对比无明显差异，说明DLC2参与某些类型血管生成反应，如肿瘤诱导的血管生成过程。　　 第四章 DLC2缺失促进血管生成机制的探讨。　　 目的：探讨DLC2缺失是否通过影响内皮细胞迁移和黏附能力而参与调控血管生成的过程；RhoGAP是否是DLC2实现功能调控的关键机制。　　 方法：⑴采用RNAi技术沉默DLC2在内皮细胞系HUVEC中的表达，观察DLC2缺失对内皮细胞黏附、迁移和小管形成能力的影响；⑵采用双重RNAi技术观察RhoA活性的下调对DLC2缺失表型的逆转。　　 结果及结论：①在内皮细胞中沉默DLC2可削弱细胞黏附能力，促进细胞迁移和小管形成；②以上作用可被RhoA沉默逆转，表明DLC2对血管生成的调控是通过RhoA途径实现的。　　 全文小结：DLC2属Rho GTP酶激活蛋白，它定位于黏着斑，并且在血管内皮细胞中高表达。DLC2对于小鼠胚胎的发育并非必需，但是它通过影响内皮细胞黏附、迁移和小管形成能力，参与血管生成的调控，此调控是通过其RhoGAP活性实现的。本研究第一次阐述了DLC2和血管生成的关系，揭示了DLC亚家族在生理学上的新功能，为黏着斑参与细胞生理学功能的调控做出了更进一步的分析，也为DLC2应用于抗肿瘤靶点奠定了理论基础。首次利用基因“插入-报告”系统和X-Gal染色建立了DLC2在小鼠体内组织器官的原位表达谱；建立了DLC2基因敲除小鼠模型，此模型可能成为新的研究血管生成的动物模型，并为进一步建立DLC2内皮细胞条件性敲除小鼠模型打下了坚实的基础。