病原菌检测是关系到食品卫生、临床诊断、环境监测等多个领域的重要研究方向之一。检测手段的创新能够迅速推动这些领域的发展。本文介绍了三种基于DNA水平的病原体检测方法的研究,其中一种和临床诊断相关,另外两种和海洋环境病原菌污染监测有关。这三种方法分别是:1)豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)的环介导等温扩增检测方法研究;2)沿岸海水中毒性创伤弧菌(Vibrio vulnificus)检测技术的研究;3)沿岸海水中致病菌污染的检测方法研究。　　 1)豚鼠气单胞菌环介导等温扩增检测方法研究　　 近些年来,有关于豚鼠气单胞菌的感染病例报道越来越多,并逐渐引起人们的重视。豚鼠气单胞菌主要在病人,尤其是儿童的粪便中分离到。目前从粪便中检测豚鼠气单胞菌的常规方法是选择性培养和生化鉴定。这些方法需要约3～5天的时间,因此难以及时给出诊断结果。用分子生物学方法检测豚鼠气单胞菌无疑是更好的选择。在本研究中,针对16S-23S rRNA基因转录间区(16S-23S rRNA internal transcribed spacer,ITS)序列,本学位论文研究设计和验证了一种环介导等温扩增(loop-mediated isothermal applification,LAMP)检测豚鼠气单胞菌的方法,并同时设计了一个特异性PCR检测方法作为LAMP法的对照。结果表明,该LAMP检测法特异性好、灵敏度高,和PCR方法相比,操作更简单,检测时间更短,并且对设备要求低,适合于推广应用。　　 2)沿岸海水中毒性创伤弧菌检测技术的研究　　 创伤弧菌是一种条件致病菌,广泛分布于河湾、沿岸海水中。它能够引起胃肠道疾病、败血症和伤口感染等病症,给沿岸居民、游客和海事工作者造成健康威胁。然而,并不是所有的创伤弧菌菌株都具有致病性。而目前已发表的从海水中检测创伤弧菌的方法中,都没有对创伤弧菌的毒性进行区分。本研究建立了两种用于检测毒性创伤弧菌的方法。一种是基于vvhA基因和viuB基因的DNA微阵列杂交法,另一种是基于创伤弧菌毒性相关基因(vcgC)的LAMP扩增方法。此外,我们分别用了60个和30个海水样本对这两种方法进行了评估,结果表明这两种方法准确、灵敏、特异性好,适合用于海水中毒性创伤弧菌的检测。　　 3)沿岸海水中致病菌污染的检测方法研究　　 随着我国渔业、海水养殖和海滨旅游等海洋相关产业的发展,海水污染越来越受到关注。而病原微生物污染是海水污染的重要方面。海水中的微生物污染的一个重要特点是来源、种类复杂多样复杂。DNA微阵列能够同时检测多种病原菌,解析度高,并且操作方便,快速,适合于海水病原菌污染监测的要求。　　 在本研究中,针对多种致病菌的16S-23S rRNA基因转录间区序列,我们设计了特异基因探针,并整合成一个检测这些病原菌的微阵列固定于尼龙膜上。使用一对通用引物用于PCR扩增这些病菌的ITS序列,并使地高辛掺入扩增产物,与DNA微阵列杂交,这一方法能够同时检测海水中自然存在的致病菌以及地表污染输入的指标菌。这些菌包括霍乱弧菌(Vibio cholerae)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolvticus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、李斯特菌(Listeria spp.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、沙门氏菌(Salmonella spp.)等。在样本处理上,采用了过滤富集法代替培养增菌,增加了检测的可靠性。因为目前使用的海水病原菌检测方法中,都需要培养增菌这一步骤,然而在低温季节,许多指标菌都处于“活的非可培养”状态,往往会导致培养富集的失败。并且由于培养条件的偏好性,不可能同时富集培养多种指标菌。我们采用了过滤富集地方法代替了培养富集方法,增加了检测的可靠性,缩短了检测时间。此外,我们选取了30个沿岸海水样本用于该方法的测试,结果表明这一DNA微阵列检测方法能够方便快速地给出丰富的指标菌污染信息,适合于海水致病菌污染检测。　　 以上三种检测技术在检测的准确度,效率,样本处理和实用性等诸多方面进行了创新,适合在相应领域应用推广。