太平洋磷虾胰蛋白酶样酶的分离纯化及其酶学性质研究

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太平洋磷虾(Euphausia pacifica)隶属于节肢动物门甲壳纲,为北太平洋亚北极区的优势种,广泛分布于远东海域、黄海及台湾海峡附近。磷虾属动物体内的胰蛋白酶样酶具有较高的生物活性和应用价值。目前,国内外学者对太平洋磷虾的研究主要局限于生态学和形态学领域。目前太平洋磷虾主要用作水产动物饵料及添加剂。对其消化酶及消化生理的研究工作尚未展开。因此,对其胰蛋白酶样酶进行分离纯化、性质及动力学研究,具有一定的理论及应用价值。本文采用5565%饱和度硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析及Sephacryl S200凝胶过滤柱层析获得分子量为31.0kDa的胰蛋白酶样酶TLEⅠ;采用85%硫酸铵沉淀、Benzamidine-Sepharose4B亲和柱层析获得分子量为59.6kDa的胰蛋白酶样酶TLEⅡ。通过研究催化BApNA水解反应的动力学过程,得出TLEⅠ的Km=(0.177±0.0185)×10-3 mol·L-1; Vmax=(7.67±0.686)×10-5 mol·L-1·S-1; Kcat=0.474 S-1; Kcat / Km =2.68×103。7种抑制剂对酶反应速率影响的实验结果表明: TPCK、PMSF、p-Aminobenzamidine对TLEⅠ表现为轻微的抑制作用,CEOM抑制作用显著,Benzamidine、STI、TLCK表现为强烈的抑制作用,该酶是丝氨酸蛋白酶。通过研究Benzamidine对TLEⅠ的抑制动力学过程,结果表明Benzamidine对TLEⅠ的抑制类型为非竞争性抑制,Ki=(6.97±0.824)×10-5mmol·L-1。8种金属离子对酶反应速率影响的实验结果表明:Hg2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对TLEⅠ有一定抑制作用,其中Pb2+和Hg2+对酶活力表现出强烈的抑制,Mg2+和Ca2+对TLEⅠ有一定的激活作用,Ni+对TLEⅠ作用不明显,Mn2+随着浓度的增大对TLEⅠ酶活力表现出先促进后抑制的作用。温度对酶稳定性影响的实验结果表明:TLEⅠ在低于20℃保持稳定,在高于
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