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随着体细胞核移植(SCNT)研究的深入,种间体细胞核移植(iSCNT)开始受到越来越多的重视,并不断取得进展。大量研究发现,核供体细胞重编程不完全或者错误,可能是导致核移植失败的主要原因。种间体细胞核移植是研究核重编程分子机制、细胞核质互作关系和早期胚胎发育的重要模型；种间体细胞核移植研究也有助于濒危野生动物的保护,在农业、医学等领域都具有广阔的应用前景。本研究借助显微操作技术,以小鼠体细胞作为核供体细胞、猪体外成熟卵母细胞为核受体细胞,进行小鼠-猪种间体细胞核移植操作,所获种间克隆胚胎置于5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养。旨在研究核供体细胞所需条件和受体卵母细胞所需条件对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响,探索影响种间核移植操作的主要相关因素,以期建立种间克隆胚胎体外生产模型,为进一步研究核重编程及核质互作机理奠定基础。M16是常用的小鼠胚胎培养液,37℃是小鼠胚胎常用的培养温度；而猪胚胎常用的培养液和培养温度分别是NCSU-23和38.5℃。将小鼠-猪种间克隆胚胎分别在37℃、38.5℃条件下,又分别培养于M16和NCSU-23培养液中,研究供体还是受体所需培养条件对种间克隆胚胎发育的影响更大。根据上述结果,将获得的小鼠-猪种间克隆胚胎在优化条件下进行体外培养,进一步研究种间核移植的影响因素,包括核供体细胞来源、核供体细胞传代次数、操作液中添加细胞松弛素B处理及卵母细胞体外成熟培养时间等。试验结果如下:
1.选择不同生理状态的小鼠进行超数排卵,分为阴门粉红色组和白色组,比较2组小鼠超数排卵成功率,结果显示阴门粉红小鼠的超排成功率为81.25％,高于阴门发白小鼠组(60.0％)。
2.将2-细胞期小鼠-猪种间克隆胚胎、小鼠自然体内胚胎置于37℃、M16培养液中培养,研究种问克隆胚胎对于供体或受体细胞培养液的适应性。于培养1、2和7 d观察2组胚胎在小鼠胚胎常规培养条件下的发育情况。结果显示种间克隆胚胎的发育能力明显低于小鼠自然体内胚胎,16-细胞与囊胚发育率分别为15.1％对80.9％和0.0％对27.7％。
3.将小鼠-猪种间克隆胚胎、猪体外受精(IVF)胚胎置于38.5℃、NCSU-23培养液中培养,研究种间克隆胚胎对于供体或受体细胞培养液的适应性。于培养1、2和7 d观察2组胚胎在猪胚胎常规培养条件下的发育情况.结果显示种间克隆胚胎的发育能力要明显低于猪IVF胚胎；iSCNT胚胎的16-细胞和囊胚发育率(9.6％和0.0％),均显著低于IVF胚胎16-细胞和囊胚发育率(30.6％和17.3%)。
4.选择NCSU-23作为小鼠-猪种间克隆胚胎培养基,分别置于38.5℃和37℃ CO2培养箱中培养,于培养1、2和7 d观察不同温度对iSCNT胚胎发育的影响。结果表明,两组卵裂率虽无显著差异,但iSCNT胚胎在38.5℃条件下的发育能力优于37℃组;8-细胞和16-细胞发育率分别为59％对29.7％和13.1％对4.7％,证明38.5℃是更适合小鼠-猪种间克隆胚胎发育的体外培养温度。
5.选择38.5℃作为小鼠-猪iSCNT胚胎的培养温度,分别置于NCSU-23、M16两种培养液中培养,于1、2和7 d观察不同培养液对iSCNT胚胎发育的影响。结果显示小鼠-猪iSCNT胚胎在NCSU-23培养液的发育能力高于M16培养液组；卵裂率与16-细胞发育率分别为71.2％对51.1％和10.9％对5.3％,表明NCSU-23培养液更适合小鼠-猪iSCNT胚胎的发育。
6.分别用小鼠胎儿成纤维细胞、小鼠卵丘细胞及不同传代次数的小鼠胎儿成纤维细胞作为核供体细胞,将获得的iSCNT胚胎培养于38.5℃、NCSU-23培养液中,于培养1、2和7 d观察克隆胚胎的发育情况。结果显示不同核供体细胞来源和2～4代的小鼠胎儿成纤维细胞来源的小鼠-猪种间克隆胚胎发育无明显差异。
7.在操作液中添加细胞松弛素B(CB),比较CB处理卵母细胞或不处理对照组所获小鼠-猪iSCNT胚胎的发育情况。结果表明,添加或不添加CB处理,所获种间克隆胚卵裂率和16-细胞发育率无显著差异。
8.比较42、44、46和48 h猪卵母细胞的pbI排出率,以及对小鼠-猪种间克隆胚胎发育的影响,结果显示44 h所获pbI排出率和种间克隆胚胎卵裂率最佳(分别为77.3％和76.1％),为本试验条件下的最佳体外成熟培养时间。
9.对所获部分16-细胞期体外受精胚胎和种间克隆胚胎进行FDA染色,鉴定其存活率,染色后均发出强绿色荧光,表明胚胎存活,所检iSCNT胚胎存活率为100％。