论文部分内容阅读
钾离子通道是细胞膜上介导钾离子运输的一类跨膜蛋白,广泛分布于人体的各大组织器官中,主要分为内向整流钾通道、双孔钾通道、电压门控钾通道和钙激活钾通道,它们在人体的生理和病理过程中发挥重要的调控作用。很多蝎毒素多肽能够特异性地作用于钾离子通道,其中具有代表性的是α-钾毒素,这为研究钾离子通道结构与功能的关系发挥了重要作用。蝎毒素中的α-钾毒素通常由2040个氨基酸残基组成,含有34对二硫键,是重要的电压门控钾通道调节剂。本课题从西藏波氏琵蝎的cDNA文库中筛选出四条α-钾毒素KTX-SP1、KTX-SP2、KTX-SP3和KTX-SP5,拟筛选出能特异性作用于与自身免疫疾病相关的Kv1.3通道的调节肽。通过基因工程制备的方法、全细胞膜片钳技术、钙离子荧光成像技术以及ELISA检测炎性因子的方法,我们获得了能够调节自身免疫反应的Kv1.3通道抑制剂KTX-SP2,为开发治疗自身免疫疾病的药物提供新型的先导活性分子。首先,本论文开展了对西藏波氏琵蝎的转录组分析与表达载体的构建。本研究通过提取西藏波氏琵蝎总RNA,经对转录组测序的结果进行分析与功能注释,筛选出四条蝎毒素多肽KTX-SP1、KTX-SP2、KTX-SP3和KTX-SP5,并以pGEX-4T-1为载体质粒,构建毒素多肽的重组质粒。其次,本论文开展了对蝎毒素多肽的重组表达与初步的功能鉴定。采用大肠杆菌原核表达体系,利用GST融合蛋白表达的方法制备出色谱纯毒素多肽,经质谱鉴定,毒素多肽分子的实际测量值与理论值基本吻合。通过全细胞膜片钳技术分别对α-钾毒素KTX-SP1、KTX-SP2、KTX-SP3和KTX-SP5进行功能鉴定,发现3μM的KTX-SP3和KTX-SP5对Kv1.1、Kv1.2和Kv1.3通道电流均无显著的抑制作用。其中,1μM的KTX-SP1能够抑制60%左右的Kv1.3通道电流,其活性大小约为700nM,而它对Kv1.1和Kv1.2通道电流无明显抑制作用。而相同浓度的KTX-SP2分别能够抑制约70%的Kv1.1通道电流和80%的Kv1.2通道电流,并且300nM的KTX-SP2就几乎完全抑制了Kv1.3通道的电流。因此,通过上述的初步研究,本课题组发现了一种新型的特异性作用于Kv1.3通道的蝎毒素多肽,为开展蝎毒素与Kv1.3通道相互作用的机制研究提供了物质基础。最后,本论文以KTX-SP2为分子探针,完成了对KTX-SP2的功能鉴定并深入研究了KTX-SP2对Jurkat T细胞的免疫调节机制。通过全细胞膜片钳技术测定了KTX-SP2对Kv1.1、Kv1.2和Kv1.3通道的活性IC50值分别为484.99±25.5nM、56.896±2.32 nM和14.72±1.98nM,对Jurkat T细胞上Kv1.3通道活性为29.094±1.12nM,而KTX-SP2对钠通道电流无显著的抑制作用,这显示了KTX-SP2对钾离子通道的选择性抑制作用。在自身免疫反应中,T细胞的激活依赖于Ca2+的信号介导和炎性因子IL-2的释放,因此,本课题通过钙离子成像技术和ELISA测定的方法证明了KTX-SP2通过阻断Kv1.3通道来抑制Jurkat T细胞内游离的Ca2+信号和炎性因子IL2的释放,为进一步研究KTX-SP2的结构与功能关系指明了正确的方向。综上所述,本论文开展了对西藏波氏琵蝎系列毒素多肽的表达纯化与功能鉴定,筛选出了特异性作用于Kv1.3通道的α-钾毒素KTX-SP2。以KTX-SP2为分子基础,本课题研究了KTX-SP2与钾离子通道的相互作用机制,并深入开展了KTX-SP2通过抑制Kv1.3通道来调节自身免疫反应的药理活性的研究,这极大地促进了蝎毒素在生物医药领域的开发与应用。