论文部分内容阅读
【目的】 1.研究糖胺聚糖和I型胶原组成的多层生物复合膜对内皮祖细胞增殖，迁移，凋亡及衰老的调节作用，并进一步研究细胞中凋亡蛋白caspase-3的表达。 2.研究糖胺聚糖和I型胶原组成的多层生物料复合膜对内皮祖细胞膜微粒（EPC-MVs）释放及功能内含物miR-126表达的影响。 【方法】 运用逐层（Layer-by-layer technology）技术将生物材料PEI（聚乙烯亚胺）、HA（透明质酸）、CO1 I（I型胶原）、CS（硫酸软骨素）按不同顺序包被培养。分为HA*-Col I组,铺板顺序(PEI-HA-ColI-HA-ColI-HA-ColI-HA）；HA-ColI*组，铺板顺序为（PEI-HA-ColI-HA-ColI-HA-ColI-HA-ColI）CS*-Col I组,铺板顺序为(PEI-CS-ColI-CS-ColI-CS-ColI-CS)和 CS-Col I*组，铺板顺序为（PEI-CS-ColI-CS-ColI-CS-ColI-CS-ColI）。从C57小鼠骨髓提取的内皮祖细胞（EPCs），培养一周后，种植到包被有四种不同生物复合膜的培养皿中和一个没有铺生物材料的培养皿（对照组）中。Di-LDL与 BS-Lectin双重染色技术鉴定EPCs。运用纳米颗粒分析仪检测EPC-MVs释放。Hoechst33258凋亡检测试剂盒及Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪检测EPCs凋亡率；β-半乳糖苷酶染色法检测多层生物复合膜对EPCs衰老的影响。细胞划痕实验和MTT实验分别检测多层生物材料复合膜对EPCs迁移和增殖的影响；Western blot实验检测凋亡蛋白caspase-3的表达；采用Real time PCR检测EPC-MVs及功能内含物miR-126的表达。 【结果】 1. EPCs及EPC-MVs鉴定实验：EPCs可以被BS-Lectin标记为绿色荧光，同时可以被Di-LDL标记为红色荧光；EPC-MVs表面CD34表达呈阳性。 2.细胞凋亡实验：血清饥饿诱导EPCs凋亡，四种多层生物复合膜组可明显抑制EPCs的凋亡，与对照组相比，有明显差异（P<0.01)。通过Western-blot实验，四种多层生物材料复合膜组凋亡蛋白caspase-3蛋白表达较对照组明显减少。于此同时，四种生物材料复合膜两两之间对内皮祖细胞凋亡的抑制作用没有明显差异（P>0.05）。 3.细胞的增殖实验：与对照组相比，四种生物复合膜组可以显著的促进EPCs增殖，有显著统计学差异（P<0.01）。而且四种生物复合膜组的促进作用相互独立，其中CS*-Col I组对EPCs的促进增殖方面最显著。 4.细胞划痕实验：与对照组相比，四种多层生物复合膜组可以显著的促进EPCs的迁移（P<0.01）。同时我们发现四种多层生物复合膜组间在促进细胞迁移方面没有显著差异。 5.衰老实验：与对照组相比，四种生物材料复合膜组可以显著抑制EPCs的衰老（P<0.01）。四种生物材料复合膜两两之间抑制EPCs衰老没有显著差异。 6. EPC-MVs释放：与对照组相比，四种多层生物复合膜组可显著促进EPC-MVs的释放（P<0.01）。同时我们发现，CS*-Col I组促进EPC-MVs的释放最为显著。HA-Col I*组微粒水平比HA*-Col I高，CS-Col I*组微粒水平低于CS*-Col I组。 7. EPC-MVs中miR-126表达：四种多层生物复合膜组可促进EPC-MVs miR-126的表达，与对照组相比,有明显差异（P<0.01)。CS*-Col I组对EPC-MVs miR-126影响最显著.HA-Col I*组miR-126表达水平比HA*-Col I高，CS-Col I*组miR-126表达水平低于CS*-Col I组。 【结论】 1. HA*-Col I，HA-Col I*，CS*-Col I，CS-Col I*四种多层生物复合膜可以抑制EPCs的凋亡和衰老，促进EPCs增殖，迁移四种生物材料复合膜两两之间对EPCs的凋亡、衰老、增殖等功能的影响各不相同。 2. HA*-Col I，HA-Col I*，CS*-Col I，CS-Col I*四种多层生物复合膜可以促进EPC-MVs释放及EPC-MVs功能内容物miR-126的表达。 3. HA*-Col I，HA-Col I*，CS*-Col I，CS-Col I*四种生物复合膜对EPC-MVs及功能内容物miR-126的表达影响各不相同，而CS*-Col I组对EPC-MVs及EPC-MVs中的功能内容物miR-126表达影响作用最为显著。