肺炎链球菌是一种常见的病原微生物，其侵入人体可引起肺炎球菌综合症（IPD）的发生，其主要病症包括：败血症、脑膜炎、肺炎及中耳炎等。肺炎荚膜多糖是一种天然抗原大分子，被广泛用于疫苗生产，但由于其不能够激起T细胞免疫，单独使用，对于免疫力低下人群，如：老人，化疗患者及2岁以下婴儿来讲效果并不明显。因此，经过研究，2000年在美国上市的7价肺炎荚膜多糖结合蛋白载体疫苗在一定程度上解决了这一问题。然而传统方法制备肺炎多糖结合疫苗的工艺中存在诸多问题，只要总结为两点：（1）由于多糖与载体蛋白均具有较大的分子量，因此所生成的肺炎多糖结合疫苗不可避免的存在空间屏蔽效应，可能导致抗原表位被遮蔽，无法更好的发挥出肺炎多糖结合疫苗的免疫学作用。（2）从工艺方面讲，传统的生产方式周期较长，往往需要5-6天甚至更长，极大的增加了生产的成本。本次实验的目的旨在利用“点击化学”在多糖与TT蛋白交联过程中引入长链Linker做为连接桥，从而使大分子间的距离增大，以减少空间屏蔽作用对肺炎多糖结合疫苗免疫学性质的影响，并缩短生产周期。一、制备偶联物。采用AKTA蛋白纯化系统与制备型Superdex200凝胶过滤柱(2.6cm×70cm)纯化破伤风类毒素蛋白，纯度达到98%，可用于实验。采用“点击化学”法进行偶联，可有效的将生产周期缩短至2天。采用AKTA蛋白纯化系统与制备型Superdex200凝胶过滤柱(2.6cm×70cm)制备结合疫苗。二、对偶联产物进行结构和免疫学性质的表征。首先利用内源荧光光谱、动态光散射技术，圆二色技术，核磁共振技术及酶解技术对2种疫苗的结构进行表征。与TT相比，发现结合疫苗的内源荧光出现明显的下降，分析认为结合疫苗中“点击化学”反应中生成的五元杂环起到荧光猝灭作用；偶联后流体力学半径都明显增加；圆二色光谱与核磁共振结果显示，偶联后TT蛋白与多糖结构均未发生明显改变；对包括两种疫苗及TT蛋白在内的3种样品进行酶解分子发现，长链连接桥可有效的降低空间位阻对多糖抗原的影响。另外，免疫学性质检测显示，长链连接桥可提高有效小鼠抗肺炎多糖IgM与IgG的抗体滴度，对所产生的IgG抗体亚型进行分析发现，长链组中IgG2a在总IgG中所占比例高于短链组，分子认为长链组疫苗可有效的激起小鼠的T细胞免疫反应。