背景与目的肺癌是引起肿瘤相关死亡的首要原因,其防治是目前我国医疗卫生领域面临的重大课题。作为最常见的肺癌亚型之一,肺腺癌的高发病率和死亡率带来了沉重的社会和经济负担。从基因调控、肿瘤干细胞等方面深入探索肺腺癌发生发展机制,寻找新的早期诊断方法和治疗靶点是肺腺癌防治的关键所在。近年来研究发现非编码RNA在肿瘤发生发展中起到重要作用,形成复杂的调控网络。环状RNA（circRNAs）是一种在转录过程中首尾相连而形成的非编码RNA分子,在许多病理生理过程中起到重要作用,其能够通过竞争性抑制微小RNA等机制影响包括肺癌在内的多种肿瘤的发生发展。尽管关于circRNAs的研究目前已经取得了一些进展,但其在肿瘤中作用的研究尚处于起步阶段,更多具有功能的circRNAs有待发现,其作用机制以及在调控网络中的角色等尚不完全明确。我们在前期芯片分析中发现肺腺癌组织中hsa_circ₀025036的表达水平显著高于癌旁正常组织,并且生物信息学分析发现其与在多种肿瘤中发挥调控作用的mi R-198存在相互作用的碱基互补配对序列,提示hsa_circ₀025036在肺腺癌中可能具有重要意义,但其在肺腺癌中具体作用及机制尚无相关报道。在本研究中,我们将首先评价肺腺癌组织中hsa_circ₀025036表达水平与患者临床病理学特征的相关性,并观察下调该circRNA表达对肺腺癌细胞增殖、凋亡和周期的影响,进而我们利用生物信息学方法和和双荧光素酶报告实验等检测hsa_circ₀025036的可能mi RNA靶点和下游基因,观测其相互作用对肺腺癌细胞生物学行为的影响,从而初步探索hsa_circ₀025036在肺腺癌中的作用及机制,明确其在肺腺癌调控网络中的作用以期发现新的早期诊断标志物及治疗靶点。本文分为两部分:第一部分:验证hsa_circ₀025036在肺腺癌组织及细胞系中的存在形式,检测其在肺腺癌组织中的表达水平并研究其对细胞增殖、凋亡及周期的调控作用;第二部分:初步探索hsa_circ₀025036调控肺腺癌细胞生物学行为的相关分子生物学机制。第一部分hsa_circ₀025036在肺腺癌组织中的表达及其对细胞增殖、凋亡及周期的调控作用方法1.依据设定的纳入和排除标准收集肺腺癌组织标本及配对的癌旁正常肺组织标本。2.PCR及DNA测序验证肺腺癌组织样本及细胞系中是否存在环状的hsa_circ₀025036。3.运用qRT-PCR检测112例肺腺癌组织及癌旁正常组织hsa_circ₀025036的表达。4.分析hsa_circ₀025036表达水平与临床病理学参数之间的关系。5.设计并合成特异性下调hsa_circ₀025036表达的siRNA及无关序列的siRNA,利用脂质体LipofectamineT M2000分别转染至肺腺癌细胞系A549和Calu-3细胞中,设立Blank组作空白对照。应用qRT-PCR检测三组细胞中hsa_circ₀025036表达水平。6.CCK-8和克隆形成实验检测下调hsa_circ₀025036对A549和Calu-3细胞增殖能力的影响。7.AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞术和和Hoechst染色检测下调hsa_circ₀025036对A549和Calu-3细胞凋亡能力的影响。8.PI染色流式细胞术及Western blot检测下调hsa_circ₀025036对A549和Calu-3细胞周期的影响。结果1.于肺腺癌组织及细胞系中发现hsa_circ₀025036的一种新亚型,该circRNA全长196 nt,由FOXM1基因5号,6号外显子及7号外显子部分序列成环组成,其BS位点位于7号外显子前22 nt尾部与5号外显子起始部位之间,我们仍称之为hsa_circ₀025036。2.与癌旁正常组织相比,hsa_circ₀025036在肺腺癌组织中表达水平显著升高（P<0.05）。3.临床资料统计结果显示hsa_circ₀025036表达水平与肺腺癌的分化程度,TNM分期及淋巴结转移有关（P<0.05）,而与患者性别及年龄无关（P>0.05）。4.下调hsa_circ₀025036对细胞增殖能力影响结果显示,si-circRNA组细胞OD值显著降低,细胞克隆团形成数目较对照组显著减少（P<0.05）。表明下调hsa_circ₀025036可抑制A549和Calu-3细胞增殖能力。5.下调hsa_circ₀025036对细胞凋亡影响结果显示,si-circRNA组细胞凋亡率显著增高（P<0.05）。表明下调hsa_circ₀025036可增强A549和Calu-3细胞凋亡能力。6.下调hsa_circ₀025036对细胞周期影响结果显示,Blank组,si-NC组以及sicircRNA组三组细胞在各个细胞周期阶段所占比例无显著差异（P>0.05）。且三组之间周期相关蛋白CDK1,Cyclin D1和Cyclin B1表达水平无显著差异。表明下调hsa_circ₀025036表达水平对细胞周期进程无明显作用。第二部分hsa_circ₀025036作用机制的初步研究方法1.生物信息学技术分析hsa_circ₀025036序列,预测可能相关的mi RNA。2.利用双荧光素酶报告实验验证hsa_circ₀025036与mi R-198存在相互作用。3.运用qRT-PCR检测112例肺腺癌组织及癌旁正常组织中mi R-198表达水平,分析其与组织来源临床病例病理学参数间的关系及其与癌组织中hsa_circ₀025036表达水平的相关性。4.应用qRT-PCR检测下调hsa_circ₀025036表达后细胞中mi R-198表达水平。5.设计合成特异性mi R-198 mimic以及无关序列的mi RNA scramble,分别使用脂质体LipofectamineT M2000转染对数生长期A549和Calu-3细胞,设立Blank组作空白对照。应用qRT-PCR检测三组细胞中mi R-198表达水平。6.检测上调mi R-198对肺腺癌细胞A549和Calu-3细胞生物学行为的影响:应用CCK-8细胞增殖检测和平板克隆形成实验评估上调mi R-198对细胞增殖能力的作用;流式细胞术检测其对细胞凋亡能力和细胞周期的影响;Western blot检测细胞周期相关蛋白表达水平的改变。7.体内实验探索上调mi R-198对肺腺癌移植瘤模型鼠的瘤体生长的影响。构建mi R-198前体序列的慢病毒重组载体,制备过表达mi R-198的重组慢病毒,感染处于对数生长期的A549-luc和Calu-3-luc细胞,应用qRT-PCR验证稳定表达mi R-198的A549-luc和Calu-3-luc细胞系,移植以构建模型鼠。利用小动物成像仪动态观察移植瘤生长,绘制生长曲线。8.生物信息学方法检索可能结合mi R-198的序列,预测潜在的靶基因。9.利用双荧光素酶报告实验验证SHMT1和TGF-α是否是mi R-198靶基因。10.mi R-198回复实验。共转染mi R-198 inhibitor及hsa_circ₀025036 siRNA至A549和Calu-3细胞,观察下调mi R-198对hsa_circ₀025036 siRNA引起的肺腺癌细胞生物学行为变化的回复作用。利用CCK-8方法检测细胞增殖能力变化;利用流式细胞术检测细胞凋亡的变化。11.SHMT1和TGF-α回复实验。构建不含SHMT1和TGF-α3’UTR的重组载体pcDNA3.1-SHMT1及pcDNA3.1-TGF-α,单独或与mi R-198 mimic共同转染至A549细胞。应用Western blot检测各组细胞中SHMT1和TGF-α蛋白水平;利用CCK-8方法检测细胞增殖能力变化;运用流式细胞术检测细胞凋亡的变化。12.运用Western blot检测下调hsa_circ₀025036表达或上调mi R-198表达后细胞中SHMT1和TGF-α蛋白表达水平。13.比较下调hsa_circ₀025036与上调mi R-198对A549和Calu-3细胞增殖和凋亡能力的影响。应用CCK-8实验检测细胞增殖能力;应用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期进程。结果1.生物信息学分析显示hsa_circ₀025036与mi R-198存在可能相互作用的互补区域。2.双荧光素酶报告实验结果显示,mi R-198 mimic与pmirGLO-Wt-circRNA组荧光素酶活性相对值显著低于其它三组（P<0.05）,而pmirGLO-Mut-circRNA与mi R-198 mimic共转染后,细胞荧光素酶活性相较参照组无明显变化（P>0.05）。表明hsa_circ₀025036可作用于与mi R-198的互补结合区域。3.肺腺癌组织中mi R-198表达水平显著低于癌旁正常组织,且mi R-198的表达下调状态与恶性临床参数TNM分期和淋巴结转移有关（P<0.05）。癌组织中mi R-198与hsa_circ₀025036表达水平呈显著负相关。4.si-circRNA组细胞中mi R-198表达水平相较对照组显著上调（P<0.05）。表明下调hsa_circ₀025036表达可上调mi R-198表达水平。以上结果提示hsa_circ₀025036对mi R-198具有负调控作用。5.上调mi R-198对肺腺癌细胞生物学行为影响结果显示,mi R-198组细胞增殖能力显著低于对照组;细胞凋亡率显著增高;S期细胞比例明显减少,而G2/M期细胞比例显著升高（P<0.05）;mi R-198组CDK1,周期蛋白D1和周期蛋白B1蛋白表达水平均显著降低。表明上调mi R-198可抑制肺腺癌细胞增殖,促进其凋亡,并引起细胞周期进程停滞。6.移植瘤生长曲线显示,mi R-198组裸鼠移植瘤荧光信号明显降低,且随时间的进展,差异越来越显著。表明上调mi R-198可抑制裸鼠移植瘤的生长。7.生物信息学分析显示SHMT1和TGF-αm RNA存在与mi R-198相互作用的互补区域。8.双荧光素酶报告实验结果显示,mi R-198 mimic与pmirGLO-Wt-SHMT1或pmirGLO-Wt-TGF-α共转染组荧光素酶活性显著低于对照组（P<0.05）。表明mi R-198可靶向作用于SHMT1和TGF-αmRNA的3’UTR。9.mi R-198 inhibitor与hsa_circ₀025036 siRNA共转染组相较si-circRNA组细胞增殖能力显著增强,而凋亡率显著降低（P<0.05）。表明mi R-198 inhibitor可回复hsa_circ₀025036 siRNA对肺腺癌细胞增殖及凋亡的影响。提示mi R-198在hsa_circ₀025036下游发挥调控作用。10.不含SHMT1和TGF-α3’UTR的重组表达载体pcDNA3.1-SHMT1和pcDNA3.1-TGF-α和mi R-198 mimic共转染后SHMT1和TGF-α蛋白水平增高,增殖能力显著增强,凋亡率显著降低（P<0.05）。表明mi R-198不能作用于无3’UTR的SHMT1和TGF-α,提示SHMT1和TGF-α在mi R-198下游发挥调控作用。11.si-circRNA组和mi R-198组细胞中SHMT1和TGF-α蛋白水平显著降低（P<0.05）。表明下调hsa_circ₀025036或上调mi R-198均可抑制SHMT1和TGF-α蛋白表达。进一步证实hsa_circ₀025036可通过hsa_circ₀025036/miR-198/SHMT1&TGF-α轴发挥调控作用。12.下调hsa_circ₀025036和上调mi R-198对细胞作用比较显示,hsa_circ₀025036和mi R-198对细胞增殖和凋亡能力作用趋势基本一致,而对细胞周期的影响不一致。提示hsa_circ₀025036还可能有其它潜在的分子生物学机制,有待于进一步探索。结论1.于肺腺癌组织及细胞系中发现hsa_circ₀025036的一种新亚型,该circRNA全长196 nt,由FOXM1基因5号,6号外显子及7号外显子部分序列成环组成,其BS位点位于7号外显子前22 nt尾部与5号外显子起始部位之间,我们仍称之为hsa_circ₀025036。2.hsa_circ₀025036在肺腺癌组织样本中高表达,且其表达水平与肺腺癌的分化程度,TNM分期及淋巴结转移情况有关。3.下调hsa_circ₀025036表达可抑制肺腺癌细胞增殖能力,促进其凋亡。4.hsa_circ₀025036/miR-198/SHMT1&TGF-α轴很可能是hsa_circ₀025036参与肺腺癌调控的机制之一。5.hsa_circ₀025036在肺腺癌中发挥促癌作用,有望成为新型的治疗靶点。