【摘 要】
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藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）是一种具有极高商业价值的亮蓝色荧光蛋白,因其具有抗氧化、抗菌、抗炎、具荧光等特性而被广泛应用于营养保健、制药、食品和化妆品等领域。C-PC的价值往往随其纯度的提高而增加,然而,C-PC对一些外在条件如光、温等敏感易降解,因此,如何快速高效的获得高纯度的C-PC具有重要的意义。三相萃取技术（Three-phase partitioning,TPP）是一
【基金项目】
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国家自然科学基金（41876149）; 山东省重点研发计划（ZR2019MD018）; 山东省自然科学基金（2019GHY112031）
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藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）是一种具有极高商业价值的亮蓝色荧光蛋白,因其具有抗氧化、抗菌、抗炎、具荧光等特性而被广泛应用于营养保健、制药、食品和化妆品等领域。C-PC的价值往往随其纯度的提高而增加,然而,C-PC对一些外在条件如光、温等敏感易降解,因此,如何快速高效的获得高纯度的C-PC具有重要的意义。三相萃取技术（Three-phase partitioning,TPP）是一种快速、简单、高效的非色谱蛋白质提取技术,目前已被应用于上游和下游生物分子的纯化过程。传统的色谱法等分离纯化程序虽然能获得纯度较好的C-PC,但通常成本高,操作复杂,处理时间长以及难以规模化生产等。而TPP方法可以为天然蛋白结构提供更有利的过程环境,满足绿色化学的需要。基于此背景,本文以硫酸铵-叔丁醇的三相萃取体系为基础,开展了其在分离纯化C-PC的应用研究,主要研究内容如下:通过反复冻融法处理钝顶螺旋藻的藻泥,对获得的C-PC冻融液进行两步盐析处理,获得C-PC粗提液（CE）建立了硫酸铵-叔丁醇的三相萃取体系,优化TPP萃取C-PC的工艺条件为90%饱和度硫酸铵盐,粗提液与叔丁醇体积比为1:1,pH7.0,10℃,该萃取条件下C-PC纯度可达到3.458,总过程回收率为52.41%。对萃取前后的C-PC样品分别进行表征,经SDS-PAGE电泳验证纯化后的样品具有该蛋白的α和β亚基,经红外、紫外、荧光光谱表征结果显示,纯化前后的蛋白样品结构与功能保持完整,证明萃取条件温和。对体系上相叔丁醇相进行蒸发回收并重新利用到TPP萃取C-PC体系中,结果表明回收叔丁醇依然具有纯化能力。通过PB实验对影响萃取过程的九个因素进行筛选,筛选出影响最大的三个因素为温度、pH和硫酸铵盐饱和度。对三个显著影响因子进行爬坡实验设计,利用三因素五水平的CCD实验结果拟合模型,筛选出最佳萃取条件并进行验证。在最佳萃取条件下进行放大十倍的研究,结果表明萃取体系稳定,具备大规模制备的可能性。测定了不同盐与叔丁醇成相情况,结果表明硫酸铵盐成相能力最强。在不同温度下进行萃取,探究三相萃取体系的热力学情况,得到拟合线性方程Y=6535.51+5.95*x,拟合度良好。通过公式计算得到ΔH的值为-6.536 k J/mol,ΔS的值为5.95J/（mol·K）。ΔG与ΔH的值均为负数,说明该反应可自发进行,该反应放热,且温度不利于反应的进行。对萃取过程进行动力学建模拟合分析,通过菲克第二定律得到拟合方程为Ct=-0.237*e-0.212*t+0.527,R~2值0.9869;Peleg模型的拟合动力学方程为Ct=0.283+t/（13.348+3.652*t）,R~2为0.9873;而二级速率定律拟合方程为Ct=t/（1.484+0.178*t）,R~2为0.334。其中Peleg定律的拟合程度最高,最符合萃取过程蛋白浓度变化情况。本研究通过实验与模型相结合的方式,优化了TPP纯化C-PC的条件,并通过动力学建模等探究了萃取过程蛋白的变化情况,证明了TPP萃取方法的快速、温和、高效,具有潜在的应用前景。
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