流感疫苗接种是目前预防流感最主要的方法。传统流感疫苗通过鸡胚接种的方式生产,但这种方式存在一定的局限性。细胞培养型流感疫苗受到越来越多的关注,如何提高流感病毒在细胞培养时的滴度是目前的研究方向之一。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对MDCK细胞系进行改造,以期获得稳定传代的犬源转化细胞系,提高流感病毒的复制能力。Tpl2是调节I型（IFNα/β）和II型（IFNγ）IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞（MOI=0.1）,测定12 h、24 h、48 h、72 h细胞培养上清的血凝滴度及72 h TCID₅₀滴度。结果:测序结果显示,获得一株Tpl2基因敲除的MDCK细胞(MDCK-Tpl2^-/-);其与亲本细胞生长速度无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12 h、24 h、48 h、72h,MDCK-Tpl2^-/-细胞培养上清的血凝滴度提高了1.78-2.5倍。病毒接种后72 h,MDCK-Tpl2^-/-细胞培养上清病毒的TCID₅₀滴度提高了2.8倍。研究结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒增殖,为细胞培养型流感疫苗的生产提供新型高产候选细胞系。流感病毒感染早期,DDX21可以通过结合病毒PB1阻断病毒的复制过程;随着病毒的感染,病毒NS1可以与PB1竞争性结合DDX21,阻断DDX21的功能并且促进病毒复制。本研究利用CRISPR/Cas9双质粒系统,分别建立DDX21基因敲除的293T/DF-1/MDCK细胞系。根据设计原则,设计靶向DDX21基因的sg RNA,构建重组质粒pUC19-DDX21-sg RNA,与p CAG-Cas9-EGFP共转染293T/DF-1/MDCK细胞,采用流式分选的方法筛选单细胞克隆株,通过靶基因组测序,筛选DDX21基因敲除的293T/DF-1/MDCK细胞系。测序结果显示获得了DDX21基因敲除的293T/DF-1/MDCK细胞系各1株,为在细胞水平上阐明DDX21在病毒复制和抗病毒天然免疫中的作用机制奠定基础。