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精子是一类遗传物质高度浓缩的细胞,与卵母细胞结合后可以形成一个完整的个体。除了遗传物质,精子还可以携带蛋白、编码RNA、非编码RNA如miRNAs等进入卵母细胞,影响早期胚胎发育。实验室前期通过精子与卵母细胞的miRNA高通量测序筛选出牛精源性miR-301a,体外获得性实验证实其参与孤雌激活(Parthenogenetic Activation,PA)胚胎第一次卵裂及囊胚形成调控。同时,鉴定出ACVR1是miR-301a的靶基因。本研究旨在对miR-301a通过靶向ACVR1参与牛早期胚胎发育调控及其分子机制做一初探。本研究进行了以下试验:(1)确定miR-301a与ACVR1在胚胎中的靶向调控关系;(2)探究敲降ACVR1对牛早期胚胎发育的影响;(3)初步探究miR-301a靶向ACVR1调控早期胚胎发育的机制。结果如下:1.体细胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT)胚胎显微注射miR-301a mimic或体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)胚胎显微注射miR-301a inhibitor后检测ACVR1 m RNA及蛋白表达情况,发现无论是m RNA还是蛋白水平,miR-301a均能下调ACVR1的表达,验证了miR-301a与ACVR1的靶向调控关系。2.PA胚胎显微注射si RNA敲降ACVR1后检测胚胎发育情况。结果表明,ACVR1敲降以后延长了PA胚胎第一次卵裂时间,但是不影响总卵裂率,同时显著提高了PA胚胎囊胚率和囊胚质量。此结果和PA胚胎注射miR-301a mimic表型相同,表明miR-301a通过靶向ACVR1调控牛早期胚胎第一次卵裂及囊胚发育。3.检测了胚胎中TGF-β通路配体BMP4及除ACVR1外受体表达,并推测BMPR2是最有可能与ACVR1互作的Ⅱ型受体。4.PA胚胎敲降ACVR1后,TGF-β通路下游信号转导Smad1/5及Smad2蛋白磷酸化水平降低,并且下调了靶基因ID1、ID2 m RNA表达。SCNT胚胎注射miR-301a mimic后同样可以引起Smad1/5及Smad2蛋白磷酸化水平的降低,然而,IVF胚胎注射miR-301a inhibitor后引起这两个蛋白磷酸化水平的升高。说明miR-301a靶向ACVR1参与TGF-β信号通路的激活。5.SCNT胚胎注射miR-301a mimic后2-细胞时期核H3K27me3荧光强度升高,IVF胚胎注射miR-301a inhibitor后无明显变化,说明miR-301a可以影响组蛋白H3K27me3修饰。6.PA胚胎中敲降ACVR1后F-actin的荧光强度降低,而IVF胚胎缺失miR-301a后F-actin的荧光强度增强,表明miR-301a可通过ACVR1影响微丝骨架动态变化。进一步研究发现,IVF胚胎中F-actin变化是由p-Cofilin1蛋白介导的。综上所述,精源性miR-301a靶向ACVR1调控TGF-β信号通路的激活,并影响微丝骨架动态变化和组蛋白H3K27me3修饰,最终延长胚胎第一次卵裂时间并提高囊胚率。