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本论文采用基因工程、分子生物学、细菌培养、细胞培养、ELISA、Western-blotting等技术,以pIPES为载体,分别将含有乙肝表面抗原的生长抑素(SS)基因和粒细胞·巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)连接到载体的多克隆位点B和多克隆位点A上,从而同时表达这两种蛋白,旨在研究该基因疫苗对仔猪的促生长作用。
从pVGS/2SS-asd基因上通过PCR的方法,分别获得目的片段GM-CSF和2SS基因。将pIRES载体的MCSA位点用NheⅠ和EcoRⅠ酶切开,将GM-CSF片段插入。然后在MCSB位点用NotⅠ、SalⅠ酶切开,将2SS基因片段插入其中。并将构建好的质粒命名为pIRES-GM-CSF/2SS,获得质粒后,通过酶切和测序鉴定基因的正确性,测序结果显示基因序列完全正确。
通过RT-PCR试验,确定GM-CSF蛋白和生长抑素蛋白可以在RNA水平上表达,通过Western-blotting检测,生长抑素基因和GM-CSF基因能在蛋白水平表达,从而确定该质粒可以在真核细胞中表达。
选择来源、体重相近的28日龄的杜×长×大断奶仔猪40头随机分为4个组,每组10头,其中A组为对照组,B、C、D组为试验组、A组肌肉注射生理盐水,试验组分别肌肉注射不同剂量的pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗,免疫剂量分别为0.25 mg、0.5 mg和1.0 mg,第一次免疫加入DDA佐剂,15 d后同样剂量加强免疫1次,但没有加入DDA佐剂。检测仔猪的生长抑素抗体水平、仔猪增重和料重比等指标,研究该基因疫苗对仔猪的促生长作用。结果表明:
1.pIRES-GM-CSF/2SS疫苗免疫后对仔猪的死亡率和腹泻率的影响
该疫苗经过去内毒素处理,免疫断奶仔猪后,仔猪的死亡率和腹泻率为0。
2.对仔猪血浆中生长抑素抗体的影响
在试验第15 d,与对照组(A组)相比,B、C和D组的抗体水平分别提高了11.33%(P>0.05)、20.0%(P>0.05)和62.67%(P<0.05),并随着注射剂量的增加,抗体也有所提高。
第30d,与对照组(A组)相比,B、C和D组的抗体水平分别提高了15.74%(P>0.05)、14.81%(P>0.05)和8.33%(P>0.05),差异均不显著。
3.对仔猪增重的影响
在注射疫苗0-15 d,与对照组相比,B、C和D组的日增重分别提高了35.88%(P<0.05)、21.17%(P>0.05)和25.61%(P>0.05)。B、C和D组的料重比分别提高了16.67%、10.0%和4.67%。
在试验的15-30 d,与对照组相比,B和C组的日增重有所降低,D组日增童提高了6.35%。B、C和D组料重比分别提高了5.06%、7.30%和3.37%。
从全期来看,A、B、C和D组的日增重分别为491.00g、521.33 g、517.67 g和554.00g。与对照组相比,B、C和D组日增重分别提高了6.18%、5.43%和12.83%。A、B、C和D组的料重比分别为1.66、1.50、1.53、1.60,与对照组相比,B、C和D组料重比分别提高了9.64%、7.83%和3.61%。
综上所述,通过酶切和测序试验证明pIRES-GM-CSF/2SS基因疫苗的构建是正确的;Western-blotting、ELISA试验证明基因疫苗的GM-CSF基因和SS基因可以在蛋白水平上表达;通过动物试验,这种基因疫苗可在一定程度提高仔猪的日增重和料重比,与其他剂量组相比,0.25 mg/头为适宜剂量。