论文部分内容阅读
棉花黄萎病严重危害棉花生产,缺少有效的控制方法。细菌鞭毛蛋白能通过激发植物的防御反应,诱导植物提高抗病性。本实验室前期研究结果表明,一种棉花内生细菌假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginos)841P-3能引起棉花防御信号和防御物质的产生,激发棉花的防御反应,提高植株对黄萎病的抗性,但机理不够清楚。植物能通过识别多种不同的细菌PAMP产生诱导抗性,其中鞭毛蛋白Flg22短肽是目前研究最深入的一种。为了研究841P-3菌株中是否存在鞭毛蛋白基因,以及这些基因与841P-3诱导棉花抗黄萎病之间的关系。本研究从841P-3的基因组DNA中克隆到4个新的鞭毛蛋白基因。将其中的FlgL基因导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,纯化得到重组鞭毛蛋白FlgL。FlgL能使烟草叶片产生过敏反应。检测了FlgL处理棉花植株后,棉花防御相关物质以及抗病相关防御酶活性,运用RT-PCR技术检测FlgL诱导棉花抗性基因和水杨酸、茉莉酸信号途径中关键基因转录水平的变化。本文实验结果如下:从Pseudomonas aeruginos 841P-3 基因组 DNA 中克隆得到FliC、FlgL、FliS,FlgK等4个新的鞭毛蛋白基因。将FlgL基因转入到大肠杆菌中表达,获得了纯化的重组蛋白FlgL,该蛋白相对分子量为46.9kD,等电点为4.63。生物活性测定显示,FlgL能引起烟草叶片产生过敏性反应。鞭毛蛋白FlgL能激发感病陆地棉品种泗棉3号和抗病品种宁抗3号抗病相关的早期信号事件的发生,包括细胞的活性氧爆发和次级代谢物质胼胝质的积累。不同品种棉花叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性都发生不同程度地提高,且抗病品种(宁抗3号)中三种酶活性增加迟于感病品种(泗棉3号)。PAL活性在4-6天时达到最大,是对照组的2倍,但是感病品种和抗病品种的PAL活性差异不显著;在处理6-8天时,POD的活性最高,抗病品种的最高活性是感病品种的3.5倍;PPO活性也发生明显增高。这些早期反应的产生说明FlgL蛋白是一种有活性的蛋白激发子。鞭毛蛋白FlgL可以诱导棉花抗性,提高棉花植株对黄萎病的抗性。FlgL诱导棉花植株后30天,可明显提高棉花对黄萎病的抗性,且对抗病品种的诱导作用强于感病品种,相对防治效果分别为43.42%和31.59%。RT-PCR结果显示,FlgL能诱导棉花防御相关基因PR-1和PR-10的上调表达,说明FlgL蛋白能诱导棉花抗病品种和感病品种产生系统抗病性。FlgL诱导不同品种的棉花叶片中水杨酸信号传递途径标记基因NPR1、POD4上调表达,不能引起茉莉酸途径中的关键基因AOS以及乙烯信号途径关键基因ERF5的上调表达,但是茉莉酸途径中的关键基因LOX表达量也发生上调,初步说明FlgL诱导棉花发生相关防御反应主要是依赖于水杨酸信号传递途径。利用双酶切将FlgL基因连接到转基因表达载体PBI121上,构建重组转基因载体PBI121-FlgL,通过农杆菌EHA105,侵染拟南芥花序,用卡那霉素在MS固体培养基上筛选,挑选阳性植株,得到T0代转基因拟南芥。本研究从细菌中克隆到4个鞭毛蛋白全长基因,通过原核表达纯化得到鞭毛蛋白的重组蛋白,并验证该蛋白也能激发棉花的防御反应,增强对黄萎病的抗性。本文不仅为控制棉花黄萎病提供了一条新途径,同时为阐明棉花内生菌841P-3诱导棉花系统抗病作用机制提供了理论依据。