【摘 要】
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目的:通过体外培养原代大鼠支气管成纤维细胞（Rat bronchial fibroblasts,RBFs）,探讨白细胞介素17A（interleukin17A,IL-17A）调控自噬对RBFs增殖、迁移及TGF-β1表达的影响。方法:1.酶联合消化法+组织贴壁法分离和培养原代RBFs;使用免疫荧光鉴定RBFs的标志性波形蛋白证实为支气管成纤维细胞。取生长状态较好的第3～4代RBFs进行实验。2.分
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目（82060005）； 贵州省科技计划项目（黔科合支撑 S[2020]2378 号）； 贵州省研究生科研基金资助项目（黔教合 YJSCXJH（2019）092）；
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目的:通过体外培养原代大鼠支气管成纤维细胞（Rat bronchial fibroblasts,RBFs）,探讨白细胞介素17A（interleukin17A,IL-17A）调控自噬对RBFs增殖、迁移及TGF-β1表达的影响。方法:1.酶联合消化法+组织贴壁法分离和培养原代RBFs;使用免疫荧光鉴定RBFs的标志性波形蛋白证实为支气管成纤维细胞。取生长状态较好的第3～4代RBFs进行实验。2.分组:对照组、IL-17A组、雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）组、Rapa+IL-17A组。3.Western Blot检测RBFs中自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的表达。4.CCK8和Ed U增殖染色法检测RBFs的增殖能力。5.细胞划痕实验法检测RBFs的迁移能力。6.ELISA法检测RBFs培养上清中转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的含量。结果:1.分离健康SD大鼠支气管组织,经酶联消化法+组织贴壁法培养RBFs,细胞呈长梭形、三角形或多边形,有突起。经免疫荧光鉴定,该细胞波形蛋白表达呈阳性,胞浆被染成绿色,细胞核染成蓝色,证实本实验的细胞为RBFs。2.WB结果显示,与对照组比较,IL-17A干预RBFs后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表达降低（P<0.05）;Rapa诱导RBFs自噬后,LC3Ⅱ/LC3I蛋白的表达较对照组增高（P<0.05）;与Rapa组相比,Rapa预处理RBFs后,加入IL-17A的干预后,IL-17A可下调LC3Ⅱ/LC3I蛋白的表达（P<0.05）。3.CCK8及Ed U增殖染色结果显示,与对照组相比,IL-17A组RBFs增殖能力增高（P<0.05）;Rapa组RBFs增殖能力较对照组降低（P<0.05）;与Rapa组相比,Rapa+IL-17A组RBFs的增殖能力上调（P<0.05）。4.细胞划痕实验结果显示,与对照组比较,IL-17A组RBFs迁移能力增强（P<0.05）;Rapa组RBFs迁移能力较对照组降低（P<0.05）;与Rapas组相比,Rapa+L-17A组RBFs的迁移能力上调（P<0.05）。5.ELISA结果显示,对照组的RBFs培养上清中有一定量的TGF-β1表达;与对照组相比,IL-17A组和Rapa组的RBFs上清中TGF-β1的表达水平增高（P<0.05）;与IL-17A组比较,Rapa组RBFs上清中TGF-β1的表达增高（P<0.05）;与Rapa组和IL-17A组比较,Rapa+IL-17A组RBFs上清中TGF-β1的表达水平降低（P<0.05）。结论:1.支气管成纤维细胞能自分泌TGF-β1。2.IL-17A通过抑制RBFs自噬促进RBFs增殖。3.IL-17A通过抑制RBFs自噬促进RBFs迁移。4.IL-17A促进RBFs分泌TGF-β1的表达可能与调控自噬有关。
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