论文部分内容阅读
禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）属于正黏病毒科A型流感病毒属。根据其表面的糖蛋白血凝素（Haemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）的不同,可将其分为16个HA亚型和9个NA亚型。近几十年来,高致病性AIVH5N1和H7N9、低致病性AIV H9N2在中国广泛传播,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失,也对公众健康存在潜在的威胁。尽管H9N2为低致病性AIV,但其宿主范围越来越广、毒力越来越强,有感染人类的可能性,因此对于H9N2AIV的超灵敏检测至关重要。在实验室检测中,检测AIV检测最常见的方法包括:抗原血凝效价测定、聚合酶链反应（polymerase chainreaction,PCR）、定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）、试纸条、酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等,这些方法各有优点,但无法同时具备操作简单、快速且灵敏的优点。表面等离子共振（surface plasmonresonance,SPR）生物传感器是近三十年发展起来的一种新兴检测仪器,可实现对靶标物质的快速、无标记检测分析,具有操作简单、灵敏度较高等优点,但这种方法达不到对靶标超灵敏检测的要求,因此,研究者们也致力于对SPR生物传感器灵敏度提升的研发。M13噬菌体是一种长880 nm,直径约6 nm的丝状病毒颗粒。M13噬菌体的衣壳蛋白有很强的展示外源蛋白分子的特性,因此被广泛应用于构建噬菌体展示库,用于筛选与目标分子特异亲和的多肽或抗体。此外,M13噬菌体结构稳定,在低于80℃、pH3.0～11.0范围可稳定存在相当长时间。此外,基因修饰后的M13噬菌体可与金属纳米粒子形成一种有机-无机复合物。M13噬菌体的这些特点,使其有潜力成为一种优良的生物探针材料,应用于检测细胞、病原体及生物标志分子。本研究通过基因编辑M13噬菌体获得一种表面修饰金纳米粒子（Aunanoparticles,AuNPs）、同时pⅢ蛋白N端展示靶分子亲和多肽的噬菌体复合探针,此探针用于SPR生物传感器,建立一种基于M13噬菌体探针的增强型SPR（enhanced surface plasmon resonance,ESPR）方法,用于超灵敏检测H9N2AIV。1、M13噬菌体的基因改造及表征M13噬菌体由pⅢ、p Ⅵ、pⅦ、p Ⅷ和pⅨ 5种衣壳蛋白组成,其中主要衣壳pⅧ含有约2700拷贝,其余为次要衣壳蛋白约5拷贝。pⅧ和pⅢ分别位于M13噬菌体的身体和尾端,根据不同蛋白对外源基因的容受性,选择8肽AuBP（Aubinding peptide,AuBP）和 7 肽 H9N2BP（H9N2 binding peptide,H9N2BP）用作探针构建。以M13噬菌体为载体,通过同源重组技术分别将AuBP展示至pⅧ N端、H9N2BP展示至pⅢN端,构建出既能与AuNPs结合又能与H9N2 AIV结合的双亲和重组噬菌体M13@H9N2BP@AuBP。ELISA结果显示,重组噬菌体具体良好的H9N2AIV特异性。同时还建立了 qPCR方法,能准确定量M13噬菌体。2、表征重组M13噬菌体特异性结合AuNPs和H9N2AIV通过对M13噬菌体进行基因修饰,重组噬菌体M13@H9N2BP@AuBP具有了双亲和AuNPs与H9N2 AIV的能力。为了探索不同直径的AuNPs对M13噬菌体pⅧ蛋白修饰的影响,筛选了直径为2nm、5nm、15nm的AuNPs进行结合。通过宏观表征、UV-Vis、TEM等方式进行表征,显示5 nm的AuNPs更适用于M13@H9N2BP@AuBP修饰。TEM结果显示,修饰AuNPs后的探针M13@H9N2BP@AuNPs仍然具有良好的H9N2 AIV结合特性。此外,探针在pH 4.0～10.0范围内能稳定保存,且探针在室温稳定保存15 d,在4℃稳定保存至少21 d,是一种稳定性好、特异性高的探针,可作为一种检测H9N2 AIV的良好探针。3、建立基于M3噬菌体的ESPR超灵敏检测H9N2 AIVSPR是用于研究蛋白质与蛋白质之间相互作用和定量研究以及确定其平衡和动力学参数的常用技术之一,近些年也开发应用于病原体检测。传统的SPR能实现无标记检测,但其灵敏度相对较低,在传统SPR的基础上加入特异性探针能显著增强信号,提高检测灵敏度。本研究利用制备的探针M13@H9N2BP@AuNPs,建立了相关性良好的ESPR方法,其标准曲线方程为y=70.469ln（x）+25.066,其中y为共振单位（resonance unit,RU）,x为H9N2AIV浓度,建立标准曲线的相关系数为R2=0.9907。在应用ESPR检测H9N2AIV时则会引起较大幅度的偏振现象,从而产生更大的RU变化,这种探针法可使检测 H9N2AIV 的检测限（limitation of detection,LOD）低至 6.245 copies/mL,检测单个样品的时长约为10 min。而传统SPR的LOD约为116.134 copies/mL,ESPR方法比SPR方法灵敏度提高约18.5倍。ESPR与qPCR进行比较时,对高浓度样品的检测,两种方法测定得到的结果相近;对低浓度样品的检测,qPCR判定为阴性,而ESPR检测出样品中含有低浓度的H9N2 AIV。4、M13噬菌体ESPR探针检测早期感染的禽流感病毒对建立的基于M13噬菌体的ESPR方法进行了进一步临床检测验证。主要通过在SPF鸡胚中接种101～104 copies/μL梯度浓度的H9N2 AIV及设置4～48 h感染时间作为检测变量,使用实验室常用的检测方法对收集的鸡胚感染尿囊液样本进行了检测。将ESPR法与抗原血凝效价测定、PCR、qPCR、试纸条等方法在灵敏度、检测时长、操作步骤等方面进行客观对比。对比结果显示,试纸条和ESPR检测耗时最短,仅需要约10 min就能得到检测结果;检测步骤从简单到复杂依次为:试纸条检测、ESPR、鸡胚血凝效价测定、PCR和qPCR;灵敏度由低到高为:鸡胚血凝效价测定＜试纸条检测＜PCR＜qPCR＜ESPR。ESPR可以检测出H9N2AIV低浓度感染及早期感染,有望应用于临床样本的快速筛查。