与传统色谱技术不同,逆流色谱的流动相和固定相均为液体,依据不同物质在两相间的差异性分配实现分离。目前已经广泛应用于小分子物质的分离,然而在蛋白质的分离应用方面却一直止步不前,很少有成功的案例报道。利用逆流色谱技术分离小分子物质过程中大部分工作集中在选择合适的溶剂体系,而分离蛋白质相当程度上还依赖于分离柱结构的改进。为此,本课题从实验和理论两个方面进行了逆流色谱技术在蛋白质分离纯化上的应用研究。首先考虑到(常规)高速逆流色谱不能实现蛋白质分离纯化可能是因为分离柱柱效低,所以我们将逆流色谱系统的进口和出口连接起来,形成循环高速逆流色谱。利用循环高速逆流色谱系统首次成功地将肌红蛋白和溶菌酶分开,其纯度分别达到了 98.3%和90.3%.然后又将这一循环系统应用到CHO细胞上清中单克隆抗体的分离纯化,通过一步离心和两步逆流色谱过程将CHO细胞上清液中单抗的纯度由14%提高至77.7%,纯度提高了 4.55倍,收率也达到72.1%.显示出了循环高速逆流色谱在蛋白分离上的巨大潜力。另一方面,本课题从理论上研究了三维圆锥螺旋柱在蛋白分离上的可行性。首先建立了 J型逆流色谱三维圆锥螺旋柱特定的经典力学模型,然后从固定相保留和相混合两个方面去评测分离柱在蛋白分离上的性能,并与目前使用最广泛的其它两种螺旋柱(二维螺旋柱和三维圆柱螺旋柱)进行对比。最后利用实验数据验证理论。理论结果表明虽然三维圆锥螺旋柱在固相保留上要稍逊于二维螺旋柱但在相混合上要优于另外两种螺旋柱,实验结果也证明三维圆锥螺旋柱在固相保留和相混合间的这种“平衡”或许恰恰是其在蛋白分离表现上优于其余两者的原因。利用理论模型去分析逆流色谱柱在蛋白分离上的可行性这一全新的研究思路不仅效率高而且更经济,或许可以作为以后该领域开发设计逆流色谱新柱型的参考和借鉴。