苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性、在生长后期可形成芽胞的土壤细菌,在形成芽胞的同时可以产生一种对多种昆虫和线虫具有特异性毒杀活性的伴胞晶体蛋白,目前,Bt已成为世界上应用最为广泛而且最为成功的生物杀虫剂。但是83%的Bt菌株为溶源菌,正是这些溶源性噬菌体的污染给Bt的发酵生产造成了严重损失,另外,Bt菌剂在施用到土壤中之后,推测土壤中的噬菌体也会影响Bt的适应性。为了更好的了解Bt噬菌体和为Bt生产应用中噬菌体的防治提供线索,本论文主要着眼于苏云金芽胞杆菌噬菌体的相关领域展开研究,主要研究内容包括苏云金芽胞杆菌噬菌体的分离及其基因组的比较分析以及新型噬菌体穿孔素蛋白Bth1的功能鉴定。主要研究结果如下:(1)苏云金芽胞杆菌噬菌体的分离及其基因组分析目前,虽然对Bt的噬菌体有了一定的研究,已经分离到了一些噬菌体,但是总的来说还比较少,不能系统的分析Bt噬菌体的种类及特征。本研究分离到了 11株溶源性噬菌体4株烈性噬菌体,包含盖病毒噬菌体、长尾噬菌体和肌尾噬菌体3种类型。宿主谱检测结果显示15株噬菌体都具有宿主专一性,只对B.cereus群菌株具有侵染能力,烈性噬菌体能侵染80%以上B.cereus群菌株,明显比溶源性噬菌体的宿主谱广。完成了 15株噬菌体的全基因组测序,溶源性噬菌体基因组多在30～60 kb之间,烈性噬菌体的基因组在150～160 kb之间,所有噬菌体的同种功能基因聚集成簇以模块形式排列。全基因组比对分析显示,BMBtp2,BMBtp11以及4株烈性噬菌体分别属于D类、A类和J类芽胞杆菌噬菌体,其余9个为新型芽胞杆菌噬菌体,包括一个类群和6个新的个体,BMBtp5,BMBtp6和BMBtp9属于一个新的类群,BMBtp1,BMBtp3,BMBtp4,BMBtp7,BMBtp8 和 BMBtp10 分别代表一个新的类型。本研究极大的丰富了 Bt噬菌体资源,为Bt的发酵生产及土壤中的有效施用提供了理论依据。(2)低丰度溶源性噬菌体的发现及其普遍性研究噬菌体是生物圈中数量最丰富的一种生物体,也以前噬菌体的形式普遍存在于细菌基因组中,对细菌的营养循环和基因转移等起到重要作用,而细菌基因组中的噬菌体大多数是未知的。本研究通过高通量测序的方法检测到了 5个低丰度的溶源性噬菌体BMBtpLAs,这5个BMBtpLAs噬菌体基因组匹配的reads只有总reads数的0.02%～0.22%,这使得低丰度的噬菌体极易被忽略。5个BMBtpLAs噬菌体的基因组大小在27～51 kb之间,注释分析表明BMBtpLAs具有典型的长尾噬菌体的基因组结构,且富含新基因。BMBtpLAs还编码9个具有特殊功能的ORF,包括细菌毒力相关的因子、染色体和质粒分离相关蛋白、毒素-抗毒素系统组分、全局性转录调控因子以及与细菌免疫相关的因子。与已报道的118个芽胞杆菌噬菌体的全基因组比对分析以及基于末端酶大亚基蛋白序列的系统发育分析表明5个BMBtpLAs代表了 3种新型的芽胞杆菌噬菌体。与B.cereus群细菌基因组的比对分析结果显示有3个BMBtpLAs噬菌体在B.cereus群细菌基因组是普遍存在的。本研究揭示了 BMBtpLAs多为新型噬菌体且其同源噬菌体在细菌基因组中是普遍存在的,推测这种低丰度噬菌体现象在其它种属的细菌中也是普遍存在的。(3)新型噬菌体穿孔素蛋白Bth1的功能鉴定穿孔素蛋白是大多数噬菌体裂解细菌的必需组分,我们在分析BMBtp1的基因组时发现其没有典型的穿孔素蛋白。信息学分析发现噬菌体BMBtp1的基因Bth1的产物具有噬菌体穿孔素的某些基本特征,qPCR实验证明Bth1参与了噬菌体的裂解循环。接下来我们构建了 Bth1的异源表达载体在E.coli中超量表达,实验结果显示Bth1在E.coli中表达时可在细胞膜上形成孔洞,抑制细胞的生长,并且以寡聚体的形式定位于细胞膜上。进一步构建了 YBT-1765的Bth1基因缺失突变体,Bth1基因缺失后,噬菌体BMBtp1不能裂解细胞,说明Bth1是噬菌体裂解关键蛋白,并且通过荧光定位实验证实Bth1也定位于Bt的细胞膜上。蛋白的比对分析结果显示,Bth1类蛋白普遍存在于细菌和噬菌体中,除Bth1基因外,存在于YBT-1765基因组上的Bth1类蛋白基因还有Bth2,生物膜形成及抗逆性实验显示Bth2基因已经被宿主所利用来应对外部环境的变化。本研究结果显示Bth1是一个新型的噬菌体穿孔素蛋白,对于Bth1的研究将有助于理解Bt和其噬菌体之间的作用关系,同样对于揭示穿孔素蛋白的进化及作用模式有极大的帮助