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研究背景:长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度超过200 nt的非编码转录本,参与了表观遗传学调控、肿瘤、免疫、生殖等生物学过程。从进化角度来看,lncRNA主要富集在灵长类动物的脑和睾丸组织中。进一步经过高通量转录组测序发现lncRNA的表达随精子发生进程逐渐上升。果蝇关键睾丸特异性lncRNA的敲除导致精子数量减少甚至不育。这表明,lncRNA对于精子发生具有非常重要的影响。研究表明,成熟精子中也存在大量m RNA及非编码小RNA,且对精子功能具有一定的影响。然而,关于哺乳动物lncRNA对精子发生的影响及其在成熟精子中的存在与功能研究仍然是一片空白。本研究拟以小鼠为模型,利用高通量测序技术,筛选和研究睾丸特异性lncRNA在精子发生和精子功能中的作用,本研究将对阐明精子发生及雄(男)性不育的精细机制具有重要意义。研究方法:收集3组精子样本和2组睾丸样本后提取总RNA,并检测其纯度和质量,编号分别为M-sperm-1,M-sperm-2,M-sperm-3,M-testes-1,M-testes-2。通过高通量转录组测序,得到小鼠精子中lncRNA的表达特征。运用精子和睾丸测序数据和GEO数据库中圆形精子测序数据,筛选出差异表达显著的lncRNA。利用GO分析(Gene Ontology,基因本体论)和lncRNA靶基因预测得到精子发生和精子功能相关的lncRNA之后,利用组织特异性或保守性分析对lncRNA进行过滤。通过RT-PCR和q PCR验证得到睾丸特异性lncRNA,并进一步进行表达研究。利用慢病毒过表达载体和基因敲除模型初步探索候选lncRNA的功能。研究结果:1.本研究获得了小鼠精子高纯度RNA,其在成熟精子中主要以小片段形式存在。2.我们系统研究了小鼠精子lncRNA表达谱。从长度分布来看,我们发现lncRNA的长度主要集中在500-2000 bp之间。从表达量分布来看,精子lncRNA的表达量比m RNA低。lncRNA的差异表达分析显示:与睾丸相比,精子中有43979个lncRNA存在差异表达,12778个lncRNA上调,31201个lncRNA下调;与圆形精子相比,精子中有37164个lncRNA存在差异表达,15148个lncRNA上调,22016个lncRNA下调。GO分析将target-m RNA分为3类,分别是生物进程(Biological processes)、细胞组分(cellular components)、分子功能(molecular functions)。精子相对于睾丸,参与生物过程最显著的是细胞大分子代谢进程(cellular macromolecule metabolic process)、生殖(reproduction)、有性生殖(sexual reproduction)、雄性配子产生(male gamete generation)、初级代谢(primary metabolic process)、精子发生(spermatogenesis);精子相对于圆形精子,参与生物过程最显著的是细胞大分子代谢进程、细胞代谢进程、生殖、有性生殖、雄性配子产生、初级代谢进程等。KEGG分析显示:精子相对于睾丸,差异表达的target-m RNA显著富集的通路主要与细胞内吞作用(Endocytosis)、癌症mi RNA(Micro RNAs in cancer)、RNA转运(RNA transport)、黏着连接(Adherens junction)等有关;精子相对于圆形精子,差异表达的target-m RNA显著富集的通路主要与细胞内吞作用、RNA转运、剪接体(Spliceosome)等有关。3.通过个性化生物信息学筛选,并进行后续RT-PCR及q PCR验证,我们获得8条精子发生及精子功能相关的睾丸特异性lncRNA。4.通过基因位置和lncRNA靶基因分析,本研究选取了精子细胞钙离子结合蛋白基因Cabs1的反义转录本及人鼠保守性lncRNA lnc5和睾丸特异性lncRNA lnc49作为研究对象进一步探究其具体功能。本研究分别构建了稳定过表达的lnc5和Cabs1的细胞系,并探讨了lnc5是否调节Cabs1基因的表达。结果显示,lnc5不影响Cabs1的RNA水平和蛋白水平的表达。本研究利用CRISP/Cas9技术分别构建了lnc5和lnc49基因敲除模型,得到F1代阳性杂合子。结论:1.本研究证实了小鼠精子除了片段化的转录本外,也存在大量完整的lncRNA,并系统研究和阐明了精子lncRNA的表达谱。2.成熟精子与圆形精子及睾丸lncRNA表达存在显著差异。差异lncRNA功能富集显示,其影响了精子发生及精子功能相关的多种生物学过程。3.根据生物信息学预测,RT-PCR和q PCR睾丸特异性验证,得到8条与精子发生及精子功能相关的睾丸特异性lncRNA。这为深入研究睾丸特异性lncRNA的生物学功能提供了研究基础。4.本研究构建了lnc5过表达载体、lnc49敲除模型和lnc5敲除模型。初步结果表明lnc5的潜在靶基因Cabs1的转录及翻译水平不依赖于lnc5表达量的变化。目前,敲除模型的表型分析正在进行中。我们将在体外和体内进一步研究lnc5对Cabs1其它方式的调节关系及lnc5和lnc49在精子发生及精子功能的作用。