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第一部分 白花蛇舌草总黄酮(HDE)抑制急性髓系白血病细胞株Kasumi-1增殖的实验研究目的 研究白花蛇舌草总黄酮(HDE)对急性髓系白血病(AML)细胞系的生长抑制作用,尤其是对AML-M2b来源的Kasumi-1细胞株的增殖抑制作用及诱导凋亡的情况,初步探究HDE抗AML的凋亡分子机制。方法 MTT法检测HDE作用AML细胞株的生长抑制作用,比较其对大部分AML来源的血液系统恶性肿瘤的增殖抑制作用;AV/PI流式细胞术检测HDE诱导Kasumi-1细胞株的凋亡情况;Hoechst33258染色法观察HDE诱导白血病细胞凋亡的形态学改变;运用流式细胞术检测药物作用后Kasumi-1细胞周期阻滞情况;Western-blot法检测HDE作用后Kasumi-1细胞Caspase家族蛋白,凋亡相关蛋白Bcl-2家族,凋亡抑制蛋白IAPs家族和细胞周期蛋白的表达,同时检测HDE对Kasumi-1细胞MAPKs信号通路相关生存蛋白的影响。结果(1)0.02-0.10 mg/mL HDE作用于Kasumi-1细胞株24小时、48小时后,IC50 分别是 0.07mg/mL、0.059mg/mL;(2)浓度为 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的HDE分别作用于Kasumi-1细胞株,24小时后行AV-PI流式细胞术检测,凋亡率分别是 5.48%、7.53%、10.75%、22.30%、28.00%、32.40%;(3)用浓度为0.02-0.06mg/mL的HDE处理Kasumi-1细胞,24小时后收集细胞进行hoechst33258染色,Kasumi-1细胞核内可见明显的凋亡小体,并且随着HDE浓度的增加凋亡小体逐渐增多,形态学上证明HDE可以诱导Kasumi-1细胞发生凋亡;(4)流式细胞术检测到0-0.10 mg/mLHDE作用于Kasumi-1细胞株24小时后,该细胞 G0/G1 期的比例依次为 36.53%、53.23%、63.91%、79.07%;(5)Western blot结果显示不同浓度的HDE能激活caspase-8、-9、-3和PARP,并能促进细胞色素C的表达;(6)不同浓度的HDE作用可以下调Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL及Mcl-1和上调促凋亡蛋白Bak、Bax,呈浓度依耐性;(7)HDE可以抑制Kasumi-1细胞IAPs家族中的XIAP、CIAP1、CIAP2和Survivin的表达,促进Smac的表达,呈浓度依耐性;(8)不同浓度HDE可以促进MAPKs信号通路中ERK、p38 和 JNK 的磷酸化;(9)HDE 可以下调 CDK2、p-CDK2、CDK4/6、CyclinE、CyclinD1,上调 p21。结论(1)在一定浓度范围内的HDE(0.02-0.1mg/mL)可明显抑制白血病Kasumi-1细胞株的增殖,呈时间浓度依赖性;(2)HDE通过线粒体凋亡信号途径诱导Kasumi-1细胞株凋亡,其凋亡机理与其激活Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白有关;(3)HDE通过影响Bcl-2家族蛋白和抑制IAPs家族蛋白的表达发挥促凋亡作用;(4)HDE 通过影响 CDK2、p-CDK2、CDK4/6、CyclinE、CyclinD1,p21使Kasumi-1细胞被阻滞于G0/G1期,抑制细胞增殖;(5)HDE对Kasumi-1细胞的MAPKs信号通路有激活作用。第二部分 HDE联合Akt抑制剂Perifosine诱导急性髓系白血病细胞株Kasumi-1凋亡的实验研究目的 研究白花蛇舌草总黄酮(HDE)联合Akt抑制剂Perifosine对急性髓系白血病细胞株Kasumi-1的杀伤作用,并进一步探讨联合作用机制,为临床白血病治疗提供新的思路和策略。方法 采用MTT法检测HDE、Perifosine单药及联合对白血病细胞株Kasumi-1的生长抑制作用,流式细胞术检测凋亡情况,Hoechst33258染色法观察药物作用后细胞凋亡的形态学改变,Western-blot检测药物联合作用后Caspase家族蛋白和PI3K/Akt/NF-κB信号通路中相关蛋白的表达变化。结果 HDE与Perifosine联合具有协同抑制Kasumi-1细胞增殖的作用,流式细胞术结果显示联合处理能引起更多的细胞凋亡;Hoechst33258荧光染色观察到联合组比单药组细胞凋亡更明显;HDE联合Perifosine诱导Kasumi-1细胞株凋亡时,Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白激活,并且能够上调CytC以及下调P-P65的表达。结论 HDE联合Perifosine能协同抑制Kasumi-1细胞增殖,其作用机制可能与PI3K/Akt/NF-KB信号通路有关。