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[目的]
构建新近发现的抑癌基因肺癌肿瘤抑制物1(TSLC1)真核表达载体及探讨重组载体对人食管癌Eca-109细胞株生长和凋亡的影响,为进一步明确抑癌基因TSLC1对食管癌可能的作用机制奠定理论基础。
[方法]
1.TSLC1基因真核表达载体的构建
1.1根据GenBank提供的TSLC1基因的cDNA序列,设计特异性引物,用RT-PCR扩增TSLC1的ORF,克隆至pMD19-T simple载体中,转化到大肠杆菌E.coliJM109中,双酶切鉴定筛选阳性克隆,进行序列测定。再将其回收后连接入真核表达载体pIRES2-EGFP表达载体中,转化宿主菌E.coli JM109中筛选。
1.2取阳性重组真核表达载体扩增抽取质粒,经双酶切鉴定后,阳性重组载体命名为pIRES2-EGFP-TSLC1,并双酶切鉴定分析证实。
2.TSLC1基因对人食管癌Eca-109细胞株生长和凋亡的影响
2.1瞬时转染食管癌细胞并鉴定TSLC1基因表达
采用阳性脂质体Lipofectamine2,000瞬时转染pIRES2-EGFP-TSLC1载体和空白pIRES2-EGFP载体至食管癌Eca-109细胞中,命名转染有pIRES2-EGFP-TSLC1的食管癌Eca-109细胞为实验组,转染有pIRES2-EGFP的食管癌Eca-109细胞为阳性对照组,野生型食管癌Eca-109细胞为空白对照组。转染48小时后抽取实验组细胞总RNA,通过RT-PCR检测TSLC1的mRNA表达情况。
2.2指标检测
2.2.1观察转染后48小时三组细胞形态学改变
2.2.2 MTT法测定转染后12～72小时三组细胞增殖与抑制
2.2.3流式细胞仪测定转染后48小时三组细胞的细胞周期
2.2.4采用Annexin-V/PI双染法测定转染后48小时三组细胞的凋亡
[结果]
1.pIRES2-EGFP-TSLC1的构建和鉴定
RT-PCR扩增获得约1400bp的TSLC1基因ORF,经限制性酶切鉴定证实后成功插入pIRES2-EGFP-TSLC1真核表达载体中。重组体pIRES2-EGFP-TSLC1经测序及Bg1Ⅱ/EcoRⅠ双酶切鉴定后得到与GenBank提供的TSLC1基因的cDNA序列(AY358334)高度同源。
2.pIRES2-EGFP-TSLC1转染后的鉴定
瞬时转染后24、48和72小时,通过荧光显微镜观察转染情况,结果显示实验组和对照组细胞带有绿色荧光;转染48小时后通过RT-PCR测定实验细胞中TSLC1基因的表达,结果显示实验组存在TSLC1基因表达。
3.细胞形态变化
实验组细胞呈圆形或椭圆形,聚集成团,细胞团之间疏散,细胞状态较差;对照组和空白组细胞呈多边形或梭形,细胞之间交织紧密,细胞生长旺盛。
4.MTT检测结果
MTT结果显示:与对照组和空白组比较,实验组细胞生长速度减慢,增殖受到明显抑制。
5.细胞周期检测结果
结果显示:实验组G0/G1期细胞比例(74.47％±1.89%)明显高于对照组(64.33±2.87,P＜0.01)和空白组(63.77±3.06,P＜0.01),而S期细胞比例(8.23%±4.24%,P＜0.05)降低,表明实验组细胞周期发生了G0/G1期阻滞。
6.细胞凋亡检测结果
结果显示:实验组细胞发生凋亡数(15.5%±5.11%)明显高于对照组(2.19±0.56,P＜0.01)和空白组(1.47±0.50,P＜0.01)。
[结论]
成功构建了pIRES2-EGFP-TSLC1真核表达载体;瞬时转染后,构建了含TSLC1基因的食管癌Eca-109细胞;TSLC1基因能明显抑制食管癌Eca-109细胞生长,并诱导细胞凋亡。