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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)是猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)的病原菌。在APP的15个血清型中，外膜脂蛋白(Outer membrane lipoprotein，OmlA)和毒素Ⅳ(apxⅣ)具有保守性，为建立种特异性检测方法提供了可能。本研究将用大肠杆菌表达系统表达的外膜脂蛋白纯化后免疫新西兰白兔，收集高免血清作为一抗，用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗兔IgG作为二抗，建立了间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent assay，IFA)。同时从高免血清中提纯IgG再标记FITC，作为荧光抗体，建立了直接荧光抗体试验(Direct fluorescent assay，FA)。这两种试验分别对血清1-13型APP标准株均出现荧光信号，而血清15型APP标准株、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌等其它相关细菌不出现阳性反应。IFA和FA对APP的最小检出浓度分别为10~4CFU／ml和10~5CFU／ml。 多聚酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)由于具有敏感快速的优点，已被成功应用于许多病原的快速检测和疾病诊断中。本研究中设计合成了一对引物，以毒素Ⅳ基因(apxⅣ)为扩增的目的基因，利用胸膜肺炎放线杆菌血清1型标准菌株为模板，经过模板制备方法和反应条件的筛选，建立了胸膜肺炎放线杆菌的PCR检测方法。该方法能从胸膜肺炎放线杆菌13个血清型(1-13型)中扩增出预期的apxⅣ基因中大小为422bp的片段；胸膜肺炎放线杆菌血清型15型、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌扩增结果为阴性。对APP的最低检出浓度是1.29×10~2CFU／ml。重复性试验说明，该方法重现性好。 对人工感染动物和139份临床送检病料进行检测，并与细菌学检测结果进行比较。实验感染动物样品细菌分离为阳性，同时用上述3种方法检测也为阳性，有较好的一致性；临床可疑病料中，有36(25.90％)株为IFA阳性，29(20.86％)株为FA阳性，42(30.22％)株为PCR阳性，从7份病料中分离到本病原。这些初步研究结果表明，所建立的荧光抗体试验和PCR诊断方法可以应用于胸膜肺炎放线杆菌感染的检测，在检出率方面优于细菌分离鉴定方法。 ApxⅣ基因是新报道的毒力相关基因，仅在感染动物体内表达，具有潜在诊断意义。而且，其与本病原毒力的相关性尚未阐明。本研究根据GenBank上发表的序列，设计了一对引物，通过PCR扩增，获得了胸膜肿炎放线杆菌血清1型的毒素ⅣA基因(apxⅣA)中2694bp的片段，用质粒pMD18-T克隆后，经序列测定和NCBI Blast同源性分析，与GenBank上的AFO21919序列高度同源，从而为蛋白质的表达和后续研究奠定了基础。