【摘 要】
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目的探讨自噬在高糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用及其相关机制。方法本实验体外培养脑微血管内皮细胞（b End.3）,分为正常培养基对照组（简称Control）、正常培养基氧糖剥夺/复氧组（简称NG）、高糖培养基氧糖剥夺/复氧组（简称HG）、高糖培养基氧糖剥夺/复氧加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组（简称HG+3-MA）及高糖培养基氧糖剥夺/复氧加自噬激动剂雷帕霉素组（简称HG+RAPA）。其中NG组正常培
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目的探讨自噬在高糖加重脑缺血再灌注损伤中的作用及其相关机制。方法本实验体外培养脑微血管内皮细胞（b End.3）,分为正常培养基对照组（简称Control）、正常培养基氧糖剥夺/复氧组（简称NG）、高糖培养基氧糖剥夺/复氧组（简称HG）、高糖培养基氧糖剥夺/复氧加自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组（简称HG+3-MA）及高糖培养基氧糖剥夺/复氧加自噬激动剂雷帕霉素组（简称HG+RAPA）。其中NG组正常培养基培养24h后,缺氧缺糖6h复氧24h;HG组高糖培养基培养24h后,缺氧缺糖6h复氧24h;HG+3-MA组高糖培养基加2mmol/L 3-甲基腺嘌呤培养24h后,缺氧缺糖6h复氧24h;HG+RAPA组高糖培养基加100nmol/L雷帕霉素培养24h后,缺氧缺糖6h复氧24h。倒置显微镜观察细胞形态变化;CCK-8检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;LDH检测细胞损伤;MDC试剂盒标记脑微血管内皮细胞自噬小体;免疫荧光、Western blot检测自噬相关因子LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、和P62蛋白表达。结果CCK-8结果提示:随着糖浓度增加,培养的脑微血管内皮细胞活性逐渐下降,选取50mmol/L糖浓度作为本实验高糖处理浓度。用CCK-8和Western blot法确定3-甲基腺嘌呤处理浓度为2mmol/L,雷帕霉素处理浓度为100nmol/L。细胞形态学可见Control组细胞形态饱满,贴壁状态良好,细胞排列密集;NG组细胞间隙增宽,部分细胞皱缩;HG组细胞排列稀疏,部分脱落浮起,贴壁细胞呈现不同程度的皱缩、变圆、变小;而加自噬抑制剂3-MA干预的HG+3-MA组细胞贴壁状态改善,脱落细胞减少;相反,加自噬激动剂RAPA干预的HG+RAPA组细胞大片脱落。CCK-8结果提示,与Control组相比,NG组细胞存活率下降,HG组细胞存活率与NG组相比显著下降;与HG组相比,加自噬抑制剂干预的HG+3-MA组细胞存活率下降,相反,加自噬激动剂干预的HG+RAPA组细胞存活率升高。LDH结果提示:与Control组相比,NG组细胞损伤率明显增高,HG组细胞损伤率又较NG组显著增高;而与HG组相比,加自噬抑制剂处理后细胞损伤率下降,相反,加自噬激动剂干预后细胞损伤率显著升高。流式细胞术结果显示,NG组细胞凋亡率明显高于Control组,HG组细胞凋亡率明显高于NG组,自噬抑制剂处理HG+3-MA组细胞凋亡率下降,自噬激动剂处理HG+RAPA组细胞凋亡率显著增高。MDC结果显示,与Control组相比,NG组自噬体形成增多,HG组自噬体生成较NG组显著增多,与HG组相比,HG+3-MA组自噬体生成减少,相反,HG+RAPA组自噬体生成显著增多。Western blot结果显示:与Control组相比,NG组自噬正相关因子LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达量增加,自噬负相关因子P62蛋白表达水平降低;HG组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达量与NG组相比明显增加,P62蛋白表达水平与NG组相比明显降低;与HG组相比,加自噬抑制剂干预HG+3-MA组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量增高,而加自噬激活剂干预HG+RAPA组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表达量增高,P62蛋白表达量降低。免疫荧光法标记自噬相关因子LC3、Beclin1和P62,结果同Western blot结果基本一致。结论氧糖剥夺/复氧能够引起脑微血内皮细胞损伤,高糖能够加重氧糖剥夺/复氧所致的脑微血内皮细胞损伤;氧糖剥夺/复氧能够激活脑微血内皮细胞自噬,高糖加重氧糖剥夺/复氧所致脑微血内皮细胞损伤与自噬增加有关。
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