氧化葡萄糖杆菌高密度培养和手性生物催化研究

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手性是自然界的普遍现象,构成生物体的基本物质都是手性分子,生命离不开手性。手性研究是当前热点,对于国民经济和科学技术发展具有重大的理论意义和实用价值。手性产品的最大市场是制药领域,包括手性药物制剂、手性原料药和手性中间体三部分。 氧化葡萄糖杆菌在生物技术工业生产中得到了很大的应用,能够催化完成包括维生素C前体在内的多种糖、醇和酸的不完全氧化,具有重大经济价值。氧化葡萄糖杆菌已被本课题组用于抗糖尿病药物的生产。 研究了氧化葡萄糖杆菌的发酵培养条件,选择了D-山梨醇作为碳源,酵母膏作为氮源,优化了的培养基配方如下:D-山梨醇,80克/升;酵母膏,20克/升;KH2PO4,2克/升;MgSO4·7H2O,0.5克/升。选择了30℃,pH6.0,接种量10%,摇瓶转速200rpm为最适培养条件。在此基础上将发酵工艺在5升和30升生物反应器进行了研究,通过优化补料分批发酵策略,菌体量比出发菌株提高至三倍,可以得到干菌体6.8克/升,对应湿菌体量达到20~30克/升,处于国内外领先水平(目前文献报道为10克/升)。 通过对于氧化葡萄糖杆菌高密度培养的深入研究,优化了流加培养的条件,可以获得8克/升干菌体的产量。在上述研究基础上,实现了连续培养,单位时间干菌体产量达到0.8克/升·小时,比批式发酵提高了95%。上述研究成果不仅对于本课题生物催化研究提供了可能,对于维生素C、酒石酸、二羟丙酮等具有重大经济价值的产品生产同样有很大参考价值。 在得到了高密度菌体的基础上,本课题组在国内外率先进行了氧化葡萄糖杆菌不对称氧化消旋1,2-丙二醇生产(S)-2-羟基丙酸(D(-)-乳酸)的研究,改进了产物的检测方法,检测到反应中存在中间产物。优化了反应条件。在底物浓度小于20g/l的情况下,可以得到D-乳酸对映体过量率(e.e)大于99%,反应转化率大于90%;在底物浓度更高的情况下,可以通过控制反应微环境和过程参数对酶活进行代谢调控,使得e.e值始终保持在99%以上。相关研究内容为国内外首次报道。 该生物催化过程由两步酶促反应组成,由双酶体系催化,反应会形成中间产物,实验证实为2-羟基丙醛。建立了氧化还原耦联体系,通过控制溶解氧浓度和外加电子受体可以有效调控与电子传递链偶合的脱氢酶活力,降低中间产物积累,产物浓度提高60%。针对氧化葡萄糖杆菌催化的这类反应建立了荧光高通量定向筛选方法。通过选择适当的荧光物质和抑制剂,建立了荧光指示筛选方案,并在诱变筛选中初步获得成功,该方法可广泛用于多种羟基酸检测和相关菌株筛选,并可用于聚酯合成微生物的初筛。 对于原位分离进行了研究,构建了催化分离耦合反应器,并获得了成功,反应过程中形成的产物可以完全分离,消除了产物抑制,提高了产物光学纯度。
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