单增李斯特菌多克隆抗体的制备及与CdS量子点偶联的研究

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单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes简称LM)是一种能引起人畜共患病的致病菌,可使人和动物患脑膜炎、败血症、流产等疾病,死亡率极高。对于LM的检测,常规检测方法虽然准确性好,但所需时间长;分子生物学方法快速、灵敏、特异性强,但成本较高,且要求较高的技术水平;VITEK(全自动细菌生化分析仪)、VIDAS(全自动免疫分析仪)等虽然快速准确、检测量大,但仪器费用颇高;免疫学中ELISA方法,操作简便、快速、灵敏,因而广泛应用于致病菌的检测。自20世纪中叶以来,一系列的免疫分析技术,如放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫以及电化学发光免疫等逐渐被创立,使得人们可以在微观领域中进行抗原和抗体的定位,对各种极微量的生物活性物质的测定达到了一个新的水平。本研究利用CdS量子点的荧光性,将其与单核细胞增生李斯特氏菌抗体偶联,用于对单增生李斯特菌进行检测,以建立一种新的检测方法。本文通过对热灭活的抗原和3%福尔马林灭活的抗原免疫新西兰大白兔,制备的多抗血清,通过间接ELISA方法测得抗体效价,发现免疫家兔50d后抗体逐渐上升,最终抗体效价为1∶12800,采用辛酸-硫酸铵方法纯化抗体得到纯度较高的IgG。通过对间接ELISA反应条件的系列摸索,确定了各组分的最适工作条件。试验结果表明,单增李斯特菌菌体抗原的最佳包被浓度为108cfu/mL;单增李斯特菌多克隆抗体血清的最佳稀释浓度为1∶800;酶标羊抗兔二抗的最佳稀释浓度为1∶2000;最佳封闭液的选择为5%的脱脂奶粉,菌体抗原的最佳封闭条件为37℃,2h;抗体与抗原的最佳反应条件是37℃,2h;酶标二抗的最佳作用条件为37℃,1h;底物显色的最佳时间是室温下10min。特异性检验表明单增李斯特菌多克隆抗体仅与李斯特菌属的某些菌种发生交叉反应,与其他的致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、纳豆芽孢杆菌、副溶血弧菌、变形杆菌、金黄葡萄球菌等李斯特菌属外的属并不发生交叉反应。应用间接ELISA检测方法,选择试验建立的最佳间接ELISA检测条件来检测对单核增生李斯特氏菌最低检测限量结果为:单核增生李斯特氏菌最低检出量为107cfu/mL。以CdCl2和Na2S为原料制备CdS量子点,通过对反应过程中的反应时间,反应物的摩尔比,稳定剂的量,反应体系的pH值一系列条件优化可以得到以下结果:CdS量子点最佳反应时间为3h,[Cd2+]∶[S2-]最佳摩尔浓度比为[Cd2+]∶[S2-]=2∶1,稳定剂巯基乙酸的量为50μL,体系最佳pH值为8,反应温度为30℃。通过EDC·HCl和NHS的作用,将单增李斯特菌多克隆抗体蛋白IgG与CdS量子点偶联,偶联后的IgG-CdS荧光强度增强了,通过血清凝集反应实验和直接免疫荧光实验可以有效的检测出LM。本研究建立了一种特异、灵敏、重复性高的检测方法。
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