单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,以下简称Lm)是人畜共患李斯特菌病(listeriosis)的主要病原菌,细菌分泌的胞外蛋白对病原细菌的生存与侵染有重要作用。谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,以下简称GDH),广泛存在于植物、动物、微生物等所有生物体中,在碳氮代谢、能量代谢中起着重要作用。在猪链球菌2型中,GDH已被证明与毒力相关。本文探讨了 GDH对Lm形态、生长、自溶能力、毒力和生物被膜形成的作用,并利用iTRAQ技术对Lm的野生株EGDe与谷氨酸脱氢酶缺失株EGDeAgdhA的胞外蛋白进行分离与鉴定,对差异表达蛋白进行生物信息学分析,从蛋白质水平探究谷氨酸脱氢酶缺失后对Lm胞外蛋白表达的影响。本文对Lm野生株、缺失株EGDeΔgdhA与回复菌株EGDeΔgdhA+pERL3-gdhA的细菌形态以及生长进行了比较。结果显示:GDH缺失对细菌形态无明显影响。在营养丰富的脑心浸液(BrainHeartInfusionBroth,简称BHI)培养基中,缺失株在对数末期生长略慢于野生株,而回复菌株在整个对数期生长均慢于缺失株。在营养贫瘠的基础培养基(Minimal Essential Medium,简称MEM)中,GDH缺失株在对数末期以及稳定期前期生长都较为缓慢,且生物量显著低于野生株,而回复菌株在对数末期以及稳定期生物量显著性高于野生株。暗示,GDH缺失主要在营养贫瘠的条件下影响Lm的生长。利用微孔板法,检测了 GDH缺失对Lm生物被膜形成能力的影响。结果显示:与野生菌株相比,当保持两菌在培养24 h和48 h生长量没有明显差异的条件下,缺失株形成的生物被膜量显著降低(P≤0.01),回复菌株形成的生物被膜量与野生株接近。利用Triton X-100诱导自溶系统检测菌株自溶能力,结果发现GDH缺失株的自溶程度显著性上升(P≤0.01),是野生株的1.25倍,是回复菌株的1.45倍。暗示GDH缺失会使Lm的自溶能力上升,生物被膜形成能力下降。对三株菌株的溶血活性、棉铃虫幼虫的半致死剂量以及主要的毒力因子LLO(由hly编码)和毒力基因调控蛋白PrfA(由prfA编码)的转录表达情况进行比较。结果显示:与野生菌株相比,缺失株中prfA基因的转录表达水平降低,对棉铃虫幼虫的半致死剂量也上升了 1.6倍。有趣的是尽管缺失株中hly基因的转录水平升高,但是溶血活性却显著降低(P≤0.01)。这暗示,GDH缺失导致细菌毒力的降低。利用iTRAQ技术对基础培养中Lm野生株EGDe与谷氨酸脱氢酶缺失株EGDeAgdhA的胞外蛋白进行分离与鉴定,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果显示,与野生株EGDe相比,缺失GDH后差异性表达的胞外蛋白有62个,其中47个蛋白表达量下调,15个蛋白表达量上调。进一步将这些差异表达蛋白同COG数据库进行比对以及功能聚类分析,结果显示,这些蛋白的功能分别属于碳水化合物转运与代谢、核苷酸转运和代谢、能量合成与转运相关、转录以及细胞膜细胞壁相关蛋白等16个功能类别;其中碳氮代谢以及能量转运相关蛋白数量最多,为24个,占所鉴定出的差异蛋白总量的38.71%。这表明谷氨酸脱氢酶是Lm中碳氮代谢和能量转运中的关键酶,该结果也较好地解释了缺失株在基础培养基中生长缓慢和生物量显著性下降的现象。同时,我们发现有3个与细菌粘附以及生物被膜形成相关的蛋白表达量下降,与细菌自溶相关的P60蛋白表达量上升,该结果与缺失GDH后菌株生物被膜形成下降以及细菌自溶能力增强的现象相符。构建GDH表达菌株pET28a-gdhA(BL21),经IPTG诱导表达和镍柱亲和层析后获得较为纯净的目的蛋白。为更进一步在蛋白质水平研究GDH在Lm中的功能奠定了基础。综上所述:GDH对Lm的生物被膜、毒力以及胞外蛋白表达方面起到了重要作用。