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由产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxigenic Escherichia coli，SLTEC)引起的断奶仔猪腹泻(Post-weaning diarrhoea，PWD)和仔猪水肿病(Edema disease，ED)是导致断奶仔猪死亡的重要传染病。该类大肠杆菌的致病性主要与粘附素和肠毒素／类志贺毒素两类毒力因子有关。细菌通过粘附素附着于猪肠道上皮细胞，细菌一旦定居于小肠粘膜上，即开始大量繁殖，并产生大量的毒素或侵入深部，损伤破坏组织引发疾病。引起PWD和ED的大肠杆菌主要产生F4(K88)和F18两类粘附素，同时可产生类志贺毒素2变异体(Stx 2e)。迄今为止，如何有效预防PWD和ED仍然是个有待解决的问题。本研究构建了能同时表达致PWD和ED大肠杆菌保护性抗原基因的重组菌，并对其免疫力进行初步评估。 与F4粘附素生物合成有关的基因簇包括10个，其中faeG编码的蛋白FaeG是F4粘附素的主要亚单位蛋白，与菌毛的粘附特性有关；与Ⅰ型菌毛相似，F18也是由多个亚单位组成，现已鉴定的亚单位有A、E、F等，亚单位A(fedA)是F18粘附素的主要结构亚单位；Stx 2e由一分子的A亚单位和五分子的B亚单位的聚合体共同构成，其中B亚单位主要与细胞受体结合有关，具有免疫原性。本研究的目的是克隆出保护性抗原基因fedA、faeG和stx2eB，并进行共表达，通过测定重组菌诱导机体产生粘膜免疫、体液免疫的水平，为PWD和ED基因工程活疫苗的研究奠定基础。 本研究利用PCR技术，分别从大肠杆菌TB1、107／86和C83907菌株中扩增出不含信号肽序列的Stx 2e B亚单位基因(stx2eB)、F18菌毛的A亚单位基因(fedA)和F4菌毛亚单位基因(faeG)，并克隆入pGEM-T easy载体中，根据蓝白斑筛选及限制酶酶切分析得到分别含有stx2eB、fedA和faeG基因的重组质粒pstx2eB，pfedA和pfaeG。对重组质粒中插入的片段进行序列测定，结果表明插入的序列与公开发表的序列完全一致。再将各目的基因，按预定阅读框架依次亚克隆入原核表达载体pGEX-6P-1的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的下游，对构建的重组质粒pFSFaeG扬州大学硕士学位论文进行酶切分析和核营酸序列分析，结果表明插入的片段与预期一致，且阅读框正确。重组质粒转化大肠杆菌BLZI后，在37Oe、IPTG诱导下进行表达。通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS一队GE电泳分析及Westem一blot鉴定，表明重组菌能正确表达GST-FedA一StxZeB一FaeG融合蛋白，即S饮ZeB一FedA一FaeG蛋白与谷肤甘肤转移酶相连组成的融合蛋白。 用重组菌口服和肌注免疫3卜35日龄的仔猪，通过对实验猪免疫后3d、7d、IOd、14d粪检菌的抗氨节青霉素试验及对其进行质粒酶切分析，结果显示该重组菌能稳定地定居于仔猪肠道至少14d，用间接ELISA方法对免疫后7d、14d、3ld和40d仔猪粪样和血清中针对F4抗原的特异性IgA以及血清中针对F4抗原邝18抗原的特异性IgG进行检测。虽然粪样和血清中一直未能测得针对F4抗原的特异性IgA，但通过对血清中针对F4抗原的特异性IgG 0D49。值与非免疫对照组及空载体细菌免疫对照组测得的OD49。值进行比较分析，结果显示重组菌经口服和肌注免疫后能诱导机体产生针对F4抗原特异性抗体IgG。由此可见，重组菌经口服免疫或肌注免疫，在激发肠道粘膜免疫的能力方面尚待进一步研究。