研究背景锌离子在胰岛β细胞的生物功能中发挥着非常重要的作用。锌转运体8 (Zinc transporter 8, ZnT8)是由SLC30A8基因编码的锌离子转运蛋白,负责把锌离子转运和集聚在胰岛素分泌颗粒中。ZnT8已经被鉴定为2型糖尿病的危险因素,并且其自身免疫抗体(autoantibodies to ZnT8, ZnT8A)最近已经被认为是自身免疫性糖尿病可靠的生物标志,可用于与健康状态和2型糖尿病的诊断和鉴别诊断。其最常见的多态性在325位氨基酸(rs13266634,C/T),既与2型糖尿病易感性相关,也与1型糖尿病自身抗体位点特异性有关。针对胰岛细胞及自身抗原的抗体,比如ZnT8抗体、谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛素瘤相关抗体2和胰岛素抗体,通常在糖尿病发病时出现、甚至早于发病,并且在发病后持续不同的一段时间。因此,自身免疫抗体是自身免疫性糖尿病风险预测和诊断的有力工具。虽然酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和放射免疫法是检测此类抗体的常用方法,但是存在着不能同时检测多种抗体、有放射性、需要仪器设备等缺陷。另外一个不足之处是由于采用无细胞表达试剂盒和真核表达方法,ZnT8蛋白的生产和抗体检测试剂的成本都比较高。SLC30A8基因的rs13266634突变和2型糖尿病的关联研究不断增加,但是各研究的结论不尽一致,部分原因在于单个研究样本较小以及研究对象所属族群不同。另外,细胞因子通过激活核因子κB (nuclear factor-KB, NF-κB)可以下调ZnT8的表达。锌指蛋白肿瘤坏死因子诱导蛋白3(tumor necrosis factor α-induced protein-3, TNFAIP3)是NF-κB负性调节因子和炎症和免疫调节的中心环节。虽然TNFAIP3在糖尿病作用的研究很多,但是在糖尿病人免疫细胞中的表达和对炎症状态下胰岛细胞ZnT8表达的影响尚无相关报道。研究目的本研究的第一个目的是经济高效地表达包含C端主要抗原位点的两个ZnT8突变体,而后用上述表达蛋白建立快速可靠的ZnT8抗体检测方法,并且该方法增加其他自身抗原后可同时检测多种自身免疫抗体。本研究另外一个目的是对SLC30A8的SNPrs13266634和2型糖尿病易感性进行meta分析。本研究的第三个目的是确定糖尿病人外周血免疫细胞中TNFAIP3的表达情况并评估胰岛细胞中炎症因子和TNFAIP3对炎症状态下ZnT8表达的调节作用。研究方法1.采用重叠延伸法对ZnT8进行定点突变,两个ZnT8 C端抗原片段通过pCold Ⅱ系统在大肠杆菌中进行表达,而后利用表达的蛋白建立斑点金免疫渗滤法(dotimmunogold filtration assay, DIGFA)进行抗体检测并以ELISA法为参考进行评价。2.通过检索PubMed和Cochrane图书馆文献并提取研究基本特征、基因型分布数据、比值比(odds ratio, OR)和95%可信区间(confidence interval, CI)。分别利用校正OR和原始基因型分布数据进行相关性评估分析,并进行敏感性分析和累积meta分析以保证结果的可靠性,而后在不同的遗传模型和最佳遗传模型下对基因型分布数据进行荟萃分析。3.分别通过定量实时聚合酶链反应和Western印迹实验分析2型和成人迟发型糖尿病及健康对照人群外周血免疫细胞中TNFAIP3的表达变化；在NIT-1细胞中检测炎症对ZnT8的作用及炎症条件下TNFAIP3过表达对ZnT8的调节。研究结果1.我们成功在大肠杆菌中表达出了两个ZnT8抗原(325位氨基酸分别为精氨酸和色氨酸),并在此基础上建立了DIGFA快速检测方法,改进后即可同时检测多种自身免疫抗体；其对ZnT8抗体检测的结果与ELISA法相比并无明显差异(p=0.22),灵敏度、特异度、准确率、约登指数以及阳性和阴性似然比分别为64.3%,、96.4%、85.7%、0.607、18.0和0.370。2.我们在meta分析中共纳入了来自于39篇研究文献的55组数据(其中24篇文献包含38组基因型分布数据)。分别利用校正OR和基因型分布数据进行等位基因meta分析结果都显示该多态性位点与总人群、欧洲人群、亚洲人群2型糖尿病发病风险相关(总人群：OR=1.147/1.157,95% CI 1.114-1.181/1.135-1.180;亚洲人：OR=1.186/1.165,95% CI 1.150-1.222/1.132-1.198；欧洲人：OR=1.100/1.151,95% CI 1.049-1.153/1.120-1.183;所有p=0.00)而与非洲人无关(非洲人：OR=1.255/1.111,95%C10.964-1.634/0.908-1.360,p=0.091/0.305)。然后在不同的遗传模型下对基因型分布数据进行了分析,都得出了类似的结论；最佳遗传模型-共显性模型分析显示CC基因型携带者比CT和TT基因型携带者患2型糖尿病的风险分别高出33.0%和16.5%。累积meta分析显示随着研究的纳入总的估计精度越来越高。3.2型和成人迟发型糖尿病人中’TNFAIP3的mRNA和蛋白表达水平显著下降且短病程(≤1年)比长病程(>1年)下降更显著。炎症因子刺激可以下调ZnT8的蛋白表达水平并激活NF-κB途径而TNFAIP3过表达可以拮抗炎症条件下ZnT8表达的下调。研究结论1.pCold Ⅱ表达系统可以在大肠杆菌中表达出具有生物活性的ZnT8蛋白；以表达的ZnT8抗原为基础建立的DIGFA方法可以快速、可靠、高效的检测ZnT8抗体,且在硝酸纤维素膜上添加加其他自身抗原后后即可同时检测多种自身免疫抗体。2.多态性位点rs13266634可能是亚洲和欧洲人群2型糖尿病易感性的重要遗传因素,但与非洲人群没有关联。3.低水平的TNFAIP3可能参与了糖尿病的发生,一部分原因可能是正常水平的TNFAIP3通过抑制炎症诱导的ZnT8表达下调从而阻止糖尿病的发生发展,反之TNFAIP不足造成炎症反应失控、ZnT8表达水平降低、胰岛素分泌异常。