目前四川冬菜的研究水平较低、缺乏系统的理论体系支撑成为制约其工业化发展的主要因素,因此对其进行系统的理论研究显得尤为迫切。本课题采用宏基因组或传统纯培养方法对不同腌制时期四川冬菜中的微生物群落结构进行了分析,探索了其在整个腌制过程中的动态变化规律,并鉴定出每个时期中的优势微生物种类和相对丰度;通过对不同腌制时期四川冬菜中亚硝酸盐、蛋白质、氨基酸、颜色以及微观形貌等指标进行分析,较为全面的描述了四川冬菜整个腌制过程中的品相变化规律;采用固相微萃取–气相色谱–质谱联用(SPME–GC–MS)技术和电子鼻(E-nose)技术对不同腌制时期四川冬菜中的挥发性成分和风味轮廓进行分析,利用主成分分析(PCA)成功区分了不同腌制时期的冬菜样品;结合宏基因组功能注释结果,分析了腌制过程中的微生物与四川冬菜中亚硝酸盐、氨基酸、颜色以及风味的关系。主要研究内容和结果如下:1.四川冬菜微生物群落结构分析(1)为全面掌握四川冬菜腌制过程中微生物群落结构的动态变化规律,采用宏基因组或传统纯培养方法进行分析,鉴定到的细菌的种类和相对丰度远大于真菌的种类和相对丰度,表明冬菜腌制过程中存在的主要微生物为细菌而不是真菌,且微生物总量随腌制时间呈下降趋势。(2)四个冬菜样品中总共鉴定到85种细菌和5种真菌。0#~3#样品中细菌种类(包括亚种)分别为55种、36种、31种和4种,真菌种类分别为1种、2种、2种和1种。(3)在0#~3#样品中同时鉴定到的微生物有1种,即短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。同时在三个样品中出现的微生物有10种,都出现在0#~2#样品中,且全部是细菌,包括3种乳杆菌、1种乳球菌、4种明串珠菌、1种嗜冷杆菌和1种魏斯氏菌。在两个样品中同时鉴定到的微生物有22种,包括19种细菌和3种真菌。(4)1#和2#样品中相同的微生物种类有24种,分别占各自微生物总种数的63%和71%,且各自样品中相对丰度排名前十的微生物中有8种相同,表明1#和2#样品的微生物菌群结构较为相似,微生物种类在四川冬菜腌制1~2年期间变化较小。(5)未腌制冬菜(0#样品)中的优势菌群为假单胞菌和节杆菌,相对丰度分别达到21.98%和6.74%;腌制中期(1#和2#样品)的优势菌群为乳杆菌,相对丰度分别达到87.88%和68.86%,其中短乳杆菌相对丰度最高,分别达到84.19%和65.97%;腌制后期(3#样品)微生物种类极少,优势菌群可能为芽孢杆菌。2.四川冬菜品相分析(1)为了解四川冬菜的食用安全性,选取腌制食品中常见的有害物质亚硝酸盐作为监测指标,对其在腌制过程中的含量变化规律进行研究。结果发现,四川冬菜腌制过程中亚硝酸盐含量呈下降趋势。腌制6个月时,亚硝酸盐含量相比未腌制时下降了70%,腌制30个月以后,亚硝酸盐含量只有1mg/kg干基~2mg/kg干基,远低于国家相关标准限量。(2)为了解四川冬菜的营养价值变化,以粗蛋白和氨基酸含量为指标,对其在腌制过程中的变化规律进行研究。结果发现,四川冬菜腌制过程中粗蛋白含量、总氨基酸含量和必需氨基酸含量均呈下降趋势。未腌制冬菜中粗蛋白含量达到30g/100g干基,到36个月时仅为6.6g/100g干基,相对于未腌制样品降低了78%;必需氨基酸在未腌制样品中占比约23%,但腌制6个月后其占比上升到33%~36%,且基本维持稳定;未腌制样品中谷氨酸和脯氨酸(非必需氨基酸)含量均高于必需氨基酸总量,而其在前6个月中分别降低了48%和89%,直接导致了非必需氨基酸比例下降。(3)为了解四川冬菜的外观及形貌变化,对四川冬菜腌制过程中的颜色和微观形貌进行观察。结果发现,四川冬菜腌制过程中茎内侧、茎外侧和叶片三个部位的初始颜色不一样,但经过长时间腌制后,整个冬菜的颜色都较为均匀,颜色经过一个由明转暗、从绿变红和自黄而蓝的过程转变,这与肉眼观察到的情况比较一致;冬菜腌制中后期(24~39个月),对颜色变化不太敏感的人(Δeab*>5.0才能分辨出颜色变化)会认为各部位之间的颜色没有差别,即使对颜色变化较为敏感的人(Δeab*>3.0就能分辨出颜色变化),也会认为腌制39个月时各部位间的颜色没有差别。微观形貌观察到四川冬菜的组织结构由清晰逐渐变得模糊,由完好逐渐变为破损。3.四川冬菜风味分析(1)为明确四川冬菜中与其独特风味相关的特征物质,采用spme–gc–ms方法对四川冬菜腌制过程中的挥发性成分进行分析。结果发现,四个不同时期冬菜中共检测出70种不同的挥发性成分。0#~3#样品中挥发性成分分别有21种、8种、32种和38种,总含量分别为379μg/g干基、44μg/g干基、968μg/g干基和325μg/g干基。(2)至少在两个不同腌制时期中出现的挥发性成分有21种,在四个不同时期中的含量分别占到总挥发性成分含量的77.3%、96.5%、89.9%和78.9%,这些成分可能对四川冬菜的风味具有重要影响。其中,在四个不同时期样品中均检测到的挥发性成分有3种,分别是异硫氰酸烯丙酯、苯乙醇和苯甲醛;在三个不同时期样品中检测到的挥发性成分有2种,分别是柠檬烯和壬醛;在两个不同时期检测到的挥发性成分有16种,它们是甲苯、(z)-β-罗勒烯、α-荜澄茄油烯、石竹烯、β-古芸烯、δ-荜澄茄烯、苯酚、丁香酚、己酸-4-十六酯、草蒿脑、茴香脑、己醛、(e,e)-2,4-二烯醛、苯乙醛、苯乙酮和β-紫罗酮。(3)为明确各腌制阶段四川冬菜中与风味相关的特征成分,分别对检测到的70种挥发性成分和21种共有成分进行pca。结果发现,两组挥发性成分都可以较好的区分不同腌制时间的冬菜样品。0#样品的风味特征主要取决于硫氰化合物、醇类和醛类物质,1#样品的风味特征主要取决于甲苯和4-氧-戊酸丁酯,2#样品的风味特征主要取决于烃类,其中大部分为萜烯类化合物,而3#样品的风味特征主要取决于醛类物质和杂环化合物。(4)为区分不同腌制时期的四川冬菜样品,采用e-nose对不同腌制时期样品的风味轮廓进行分析。结果发现,可以利用风味差异来判断四川冬菜的腌制程度;e-nose主要依靠第一组传感器区分不同腌制时期的冬菜样品,尤其依靠ly2/gctl、ly2/gh、ly2/aa和ly2/g四个传感器进行区分。4.微生物宏基因组分析(1)为深入分析四川冬菜微生物宏基因组注释信息,分别对kegg和eggnog注释结果进行了统计。结果显示,0#、1#和2#样品中在kegg中分别注释上256、197和215条代谢路径,其中三个样品中同时注释上的代谢路径有178条;注释到kegg路径上的主要微生物为乳杆菌和假单胞菌。0#、1#和2#样品中通过eggnog注释上的cog功能分类分别有23、20和21类,三个样品中有20个功能分类都相同。(2)为了研究四川冬菜中微生物与亚硝酸盐降解之间的关系,对亚硝酸盐降解途径及其基因注释结果进行了分析。结果表明,与四川冬菜中亚硝酸盐代谢相关的微生物有罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、泊库岛食烷菌(alcanivoraxborkumensis)和莫拉盐单胞菌(halomonasmaura)。亚硝酸盐的降解途径为:1#和2#样品中,胞外亚硝酸盐转运到胞内后在还原酶的作用下转变成氨;或者进一步在谷氨酰胺合成酶或谷氨酸合成酶的作用下,转变为谷氨酰胺或谷氨酸,再参与到谷氨酸的代谢中,进一步在不同酶的作用下转变为琥珀酸、1-吡咯啉-5-羧酸和磷胺类物质等,最后又参与到其它代谢途径中。0#样品中亚硝酸盐的代谢除了上述途径外,还会在一系列还原酶的作用下降解为一氧化氮和一氧化二氮。(3)为了研究四川冬菜中微生物与氨基酸代谢之间的关系,对氨基酸代谢途径及其基因注释结果进行了分析。结果表明,与四川冬菜中氨基酸代谢相关的微生物种类较为多样,除了乳杆菌与假单胞菌外,还有其它杆菌、球菌等。微生物主要参与氨基酸降解活动,而对氨基酸合成的贡献相对较小;氨基酸之间的相互转化可能是必需氨基酸和非必需氨基酸比例发生变化的原因之一。(4)为了研究四川冬菜中微生物与颜色之间的关系,对可能与颜色代谢相关的途径及其基因注释结果进行了分析。结果表明,注释上的与颜色相关的微生物仅有门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina),出现在0#样品的KO00860路径上;在该路径上,2#样品比0#和1#样品中多注释上一种氧依赖性前卟啉原氧化酶(EC:1.3.3.4),该酶可以将无色的原卟啉原IX氧化成紫褐色的原卟啉IX,这可能是2#冬菜比1#冬菜的颜色看起来更暗的原因之一。(5)为了研究四川冬菜中微生物与风味之间的关系,对可能与风味相关的代谢途径及其基因注释结果进行了分析。结果表明,在假定挥发性成分与四川冬菜风味相关的前提下,注释上的与风味相关的微生物主要有乳杆菌、假单胞菌、单胞菌和球菌等。在KO00900路径上,萜烯类化合物的生物合成主要有MP和MEP/DOXP两条途径;0#和1#样品中分别通过MEP/DOXP途径和MP途径参与到KO00902、KO00909和KO00130路径中;2#样品中主要通过MP途径进一步参与到KO00902和KO00909路径中。