前言:肾脏的功能随年龄增长而逐年下降,衰老是进展性肾脏疾病的一个重要的危险因素。正常的衰老过程是器官对各种急性和慢性伤害做出的动态平衡的响应。学术界将衰老定义为:随年龄增长而发生的机体功能下降及生理功能紊乱的全身性表现。肾脏是人体中有重要生理功能和意义的器官,也是衰老出现较早的器官。我国是人口大国,随着经济的发展和社会的进步,我国正逐渐步入老龄化社会,而老年人正是慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)的高危人群。肾脏的衰老可以体现在大体(病理)层面和细胞层面,在其衰老过程中无论整体功能、结构,还是细胞水平的细胞功能,甚至分子生物学、表观遗传学等层面都会发生一系列复杂的改变。细胞水平的衰老目前没有统一的金标准,而肾脏从整体到细胞系统的衰老相关研究更是极为少见。因此,探索衰老过程中各相关信号转导通路的变化及机制,显得尤为重要。细胞水平的衰老作为器官衰老的重要分子标志之一,同时也参与调节肾脏衰老的进程。端粒与非端粒因素(例如氧化应激、线粒体DNA损伤等)最终通过p16/Rb或ARF/p53途径导致应激性早老性衰老的发生,导致肾脏对损伤的敏感性增加,修复能力下降,最终导致肾脏的衰老。尽管单一的细胞衰老标志仍未明确,但是一些研究通过体内细胞衰老的实验逐渐发现了一些相对可靠的标志物,例如p53、p21、p16、Rb及衰老相关β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-gal)。大部分研究认为肾脏衰老主要是由于肾脏固有细胞功能减退所致,而肾小球系膜细胞(Mesangial cells,MCs)是肾脏重要的固有细胞之一,具有维持肾小球系膜区细胞外基质代谢平衡的重要作用,其表型和功能改变在肾脏衰老进程中发挥着重要的作用。STAT5可以以多种方式介导细胞的衰老。有文献指出,在肺癌中,组成性激活的STAT5可以介导细胞线粒体功能受损,产生过量活性氧,最终直接引起氧化性DNA损伤效应(DNA Damage Response,DDR)DDR导致P53表达上调,进而导致衰老的发生。STAT5也可通过间接方式在细胞衰老的过程中起作用。同源或异源的STAT5二聚体进入细胞核后可以调控多种下游基因的表达,如:细胞周期调节因子cyclinD1、cyclin D2、p21WAF/Cip1、p27kip,以及抗凋亡基因Bcl-xl和Bcl-2,进而影响细胞的衰老过程。然而这些研究成果多集中于肿瘤领域,在肾脏中,尤其在肾小球系膜细胞中,几乎没有相关报道。自噬是细胞通过溶酶体对自身损伤、衰老的细胞器及生物大分子等进行吞噬降解,维持细胞内环境稳定的一种保护机制,在人类的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病等疾病的发病中具有十分重要的作用。自噬又被划分为:巨自噬(macroautophagy)、分子伴侣自噬(chaperone-mediated autophagy)和微自噬(microautophagy),其中巨自噬是自噬最经典、特征最为完整的形式,因此本研究中选取巨自噬作为观察的对象。细胞外有高血糖、终末糖基化产物(advanced glycation end products,AGEs)等刺激因子,细胞内处于氧化应激和内质网应激等病理状态,均会导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),腺苷酸活化蛋白激酶和氧化辅酶依赖的组蛋白去乙酰化酶等主要营养信号通路的异常,从而影响自噬功能。自噬活性下降可能会导致受损细胞器和衰老相关性修饰蛋白无法有效清除,在细胞内聚集,直接或间接导致细胞衰老。目前有少数研究提示自噬可能参与调控肾脏衰老。除上述自噬水平低下的情况外,过高的自噬水平(过度自噬)也会造成细胞内环境的严重紊乱,促进细胞的衰老。现已发现自噬在急性肾损伤、衰老相关的肾脏疾病、糖尿病肾病和多囊肾等肾脏疾病的病理生理过程中有重要的意义。本团队在之前的研究中已经证实:高糖/AngⅡ诱导可以诱导人肾小球系膜细胞(Human Glomerular Mesangial Cell,HGMC)衰老,而STAT3信号转导通路介导的自噬在在这一过程中发挥了重要作用。2018年,本团队进一步发现在人体自然衰老相关性肾小球硬化的过程中,STAT3信号转导通路激活,并伴有自噬水平的显著下降,首次在在体人肾组织中证实了上述结论。STAT5与STAT3同属信号转导与转录激活因子家族(Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT),其上游具有一定的重合性,在一些研究中,也发现STAT3与STAT5可能存在协同关系,但各自有具有独立性。因此,本研究探讨STAT5信号转导通路及自噬在人肾小球系膜细胞衰老过程中的作用机制。方法:第一部分:收集2015年02月-2017年02月期间,于中国医科大学附属第一医院泌尿外科,因泌尿系局限性肿瘤或肾脏外伤行全肾切除术的患者肾皮质组织20例,排除合并弥漫性肾脏病、明显肾功能不全和/或蛋白尿、合并糖尿病、高血压、乙型肝炎、血液病、结缔组织病等可能影响肾脏的系统性疾病。入选患者术前均未接受过放疗和化疗治疗。术中取材并立即行石蜡包埋或液氮冻存,经HE、Masson等常规病理手段检测肾小球硬化程度、系膜基质及系膜细胞增殖程度、衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色、免疫组化和Western Blot检测衰老相关标志蛋白P16,综合上述多种检测手段,结合患者自然年龄,综合评估患者肾脏组织的衰老水平,并将患者分为衰老和年轻两组。Western Blot检测肾脏组织中pSTAT5表达情况,制备肾脏组织石蜡病理切片,免疫组化检测p-STAT5表达水平,用于评估两组间STAT5通路激活水平变化。Western Blot及免疫组化方法检测人类肾脏标本中,自噬相关蛋白LC3水平,用于评估两组间自噬水平的变化。通过上述筛查,初步发现在肾脏衰老过程中STAT5通路和自噬水平的变化,为第二部分研究提出假设。第二部分:体外培养人肾小球系膜细胞,以250mg/L终末糖基化产物(Advanced Glycation End products,AGEs)或等体积牛血清白蛋白(Bovine Serum Album,BSA)分别刺激体外培养的人肾小球系膜细胞(Human Glomerular Mesangial Cells,HGMC)细胞12、24、48、72小时,Western Blot检测衰老相关蛋白、β半乳糖苷酶原位染色,观察比较各组细胞衰老水平,建立并验证人肾小球系膜细胞衰老模型,获得AGEs诱导肾小球系膜细胞衰老的最佳条件。250mg/L AGE刺激细胞72小时建立衰老组,等量BSA刺激细胞建立对照组,shRNA特异性沉默STAT5再以AGEs刺激72小时建立shRNA组,AGEs与1ug/ul氯沙坦共同刺激细胞72小时,建立氯沙坦组。同上方法检测各组衰老水平;Western Blot检测各组终末糖基化产物受体(Receptor of Advanced Glycation End products,RAGE)和pSTAT5水平,评估各组的RAGE-STAT5通路激活水平;Western Blot检测各组衰老相关蛋白LC3、透射电镜观察各组自噬性空泡数量、LC3-GFP-mRFP自噬荧光双标腺病毒转染上述各组细胞,荧光共聚焦显微镜观察并计数每个细胞中自噬光斑数量,综合上述各检测方法评估各组自噬水平。比较各组RAGE-STAT5水平、衰老水平和自噬水平,分析STAT5及其调控的自噬在人肾小球系膜细胞衰老过程中的作用和机制。再以AGEs和自噬的特异性抑制剂3-MA刺激细胞,比较两组的RAGE-STAT5水平、衰老水平、自噬水平,进一步确认STAT5对衰老的调控作用是用过调控自噬实现的。第三部分:40只健康雄性SD大鼠随机分为3组。第一组10只雄性SD大鼠正常饲养6个月后处死取材,建立年轻对照组。第二组15只雄性SD大鼠正常饲养6个月后,不予其他干预,继续正常饲养至20月龄后处死取材,建立衰老组。第三组15只雄性SD大鼠正常饲养6个月后,予氯沙坦30mg/kg/d灌喂,饲养至20月龄处死取材,建立氯沙坦组。培养过程中死亡的大鼠不予取材,出现严重的疾病时予以人道毁灭且不予取材。各组均有10只SD大鼠最终成功取材。大鼠予生理盐水心脏灌流后,分离获取全肾标本,再于冰上切割分离获得肾皮质,石蜡包埋或立即深低温保存。Western Blot方法和免疫组化方法检测各组pSTAT5水平,Western Blot检测各组RAGE、STAT5水平,分析各组的RAGE-STAT5通路水平;Western检测各组LC3、p16,评估各组衰老和自噬水平。比较各组RAGE-STAT5和衰老、自噬水平,在体验证第一、第二部分所得的结论。实验结果:第一部分:老年组肾皮质中肾小球硬化程度较年轻组显著升高,衰老相关蛋白P16水平也显著提升。但是自然年龄与p16的Western Blot检测IOD水平、肾小球Masoon染色所示硬化水平均无线性相关性。石蜡切片经免疫组化检测发现,老年组LC3水平较青年组显著降低(p<0.0001),提示老年组肾脏组织中自噬水平降低。组织蛋白提取物经Western Blot检测发现,老年组RAGE和pSTAT5水平较年轻组具有显著升高(p