在细胞分裂过程中,保证遗传信息完整准确的传递给子代细胞至关重要。而在细胞分裂过程中,如果出现外界原因引起的DNA序列断裂或者突变,就有可能将错误的遗传信息传递给子代细胞,这可能会导致子代细胞的癌变或者死亡。因此细胞进化出一套在细胞分裂时监控和修复DNA损伤的机制。细胞周期调控信号系统是这套机制的重要组成部分,它们在DNA损伤时停止细胞的分裂,将细胞停滞在相应的分裂期,使修复损伤获得时间。如果损伤不能修复,细胞则继续停滞或进入凋亡以及转化。这一信号系统由许多细胞周期相关蛋白和转录因子组成。其中调节细胞进入有丝分裂的重要激酶是Cdc2,其与Cyclin B结合启动细胞的有丝分裂。Cdc2的活性受多种信号分子调节,其中包括p53、p21、 Cdc25等分子。这些分子通过改变Cdc2的磷酸化状态,控制其与Cyclin B的结合,或者通过控制Cdc2的表达水平进而调节细胞周期的进程。p53可通过抑制Cdc2的启动子抑制Cdc2的表达。p53对Cdc2启动子的抑制还需要p21、Rb以及E2F4的参与。Rb和E2F4可以结合到Cdc2启动子的CHR (cell cycle genes homology region)区域,抑制Cdc2启动子的活性。而p21可以抑制CDKs的活性,后者可以磷酸化Rb,使Rb和E2F4从启动子上脱离,导致抑制状态解除。近来发现Rb还可以与PcG蛋白家族成员HPC2结合,共同形成转录抑制复合体抑制Cdc2和Cyclin A的表达,阻止细胞进入有丝分裂。HPC2是本研究关注的蛋白,其所在的PcG蛋白家族在在细胞增殖、干细胞、肿瘤发生方面发挥着重要作用,它们通过形成转录抑制复合体调节着基因的开关,维持细胞不同时期的身份和功能。因此必定有某种机制,调节这些不同信号通路的蛋白发生联系,介导它们的结合与解离。本研究致力于研究PcG蛋白,尤其是HPC2所在的Polycomb repressive complex1(PRC1)如何在在细胞周期调控中发挥作用,以及PRC1与相关蛋白比如Rb相互作用和结合的机制。本实验室曾通过噬菌体展示技术,发现HPC2可以在体外与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶p38特异结合。本研究小组赵明教授的研究证实,p38的活化参与了γ射线引起的人骨肉瘤细胞G2/M期阻滞。因此可以假设,当细胞DNA发生损伤时,p38可能通过磷酸化HPC2启动了PcG蛋白复合体的组装,介导其与Rb、E2F4等转录因子结合,并共同作用于cdc2等蛋白的启动子,抑制其表达,从而引起细胞周期阻滞。为了验证研究假设,本研究构建了HPC2标签融合真核表达载体以及磷酸化位点突变真核表达载体,Rb真核表达载体、Ring1真核表达载体,通过免疫共沉淀技术和免疫荧光技术观察它们在细胞内同内源性p38蛋白的相互作用；寻找p38与HPC2相互作用的结构域和p38磷酸化HPC2的位点；研究HPC2磷酸化位点突变载体与其他PcG小体成员的相互作用关系；进而分析p38以及HPC2分别在亚砷酸钠引起的U20S细胞G2/M阻滞中发挥的作用,探索p38与PcG小体转录抑制功能之间的关系。研究方法：1、利用亚砷酸钠刺激人骨肉瘤U20S细胞,用75%酒精固定穿透细胞,PI染色并用流式细胞仪观察细胞,制备G2/M期阻滞细胞模型；2、在亚砷酸钠刺激的细胞内,过表达HPC2-V5蛋白,按照实验分组,将细胞裂解液通过标记了V5单克隆抗体的柱子,将沉淀下来的蛋白变性,通过免疫印迹实验,验证p38与HPC2的结合。3、在U20S细胞过表达HPC2-V5,再给予细胞不同时间的亚砷酸钠刺激。然后固定细胞,用荧光标记的抗体定位V5和内源性p38,进而研究两者在细胞内的分布和相互之间的共定位关系；4、通过分析HPC2的结构,确定其保守结构域,构建相应的敲除载体。将其分别在U20S细胞过表达,再通过免疫共沉淀将与HPC2结合的蛋白沉淀下来,用免疫印迹技术检测其与内源性p38的结合,寻找两者结合的功能域；3、用p38抑制剂和HPC2stealth RNA分别处理细胞,再给予亚砷酸钠刺激,验证p38和HPC2在U20S细胞G2/M期阻滞中发挥的作用；4、通过生物信息学软件预测HPC2可能的p38磷酸化位点,并突变这些位点,再通过激酶实验验证磷酸化位点的功能；5、将突变的HPC2质粒转染到细胞内,验证HPC2的磷酸化位点在亚砷酸钠引起的细胞G2/M阻滞中发挥的作用；6、将HPC2位点突变质粒和Ring1在U20S细胞内过表达,通过免疫共沉淀技术将与HPC2以及HPC2位点突变体结合的蛋白沉淀下来,通过免疫印迹观察磷酸化位点突变后,HPC2与Ring1结合能力的变化。研究结果：1、在正常U20S细胞,G1细胞占绝大多数；但亚砷酸钠刺激24h后,U20S细胞Cdc2表达水平下降,同时G1细胞比例明显下降,G2/M细胞比例明显升高,细胞进入G2/M期阻滞。亚砷酸钠持续刺激后,细胞持续阻滞在G2/M期,直至凋亡:2、用腺病毒Ad-MKK6b E激活p38上游激酶,进而激活p38后,同样可以诱导U20S细胞G2/M期阻滞；用腺病毒Ad-MKK3/6A或者抑制剂SB203580阻断p38通路,可抑制亚砷酸钠诱导的U20S细胞G2/M期阻滞；用特异的RNA干扰阻断HPC2表达也可以明显抑制亚砷酸钠诱导的G2/M期阻滞；3、亚砷酸钠可以诱导p38和HPC2在U20S细胞内结合；而且这种结合具有时间效应,当10μM的亚砷酸钠刺激U20S细胞时,从30min开始,p38和HPC2就有明显的结合,而在刺激60min后,两者的结合量达到顶峰,120min后开始下降。4、通过激光共聚焦显微镜观察发现：正常情况下,过表达的HPC2定位于细胞核,而内源性p38主要位于胞浆。亚砷酸钠刺激U2OS细胞后,p38大量进入细胞核,标记了FITC的HPC2和标记了Texas Red的p38有明显共定位；而随着刺激时间的延长,共定位减少；并且在刺激2h之后,部分HPC2同p38从细胞核迁移到了细胞浆,其机制和原因不明；5、将HPC2的保守结构域敲除,构建出敲除突变体,并将其转入U2OS细胞,过表达,再通过免疫共沉淀观察其与内源性p38结合的情况。发现,HPC2氨基末端1到373位的氨基酸序列负责其与p38的结合,敲除这段序列后,p38与HPC2不能结合。6、将HPC2的序列敲除突变体转入U2OS细胞,并分别用FITC和Texas Red标记的抗体标记HPC2和p38后,观察它们在细胞内的分布情况。发现敲除了HPC2氨基末端1到373位氨基酸后,HPC2与p38的共定位明显减少；而包含有1到373位氨基酸的突变体可以同p38共定位。同时还发现,HPC2羧基末端的COOH盒也参与了HPC2与染色质的结合。7、通过生物信息学软件分析HPC2氨基酸序列后发现,HPC2有多个可能的p38磷酸化位点。挑选其中评分较高的6个位点,其中4个丝氨酸位点,2个是苏氨酸位点,分别将其突变。将这些突变载体转入U2OS细胞后,再用亚砷酸钠刺激细胞。观察HPC2突变体对细胞周期的影响。实验发现,突变了HPC2的苏氨酸497位点后,亚砷酸钠诱导的G2/M阻滞得到明显抑制；同时过表达HPC2T497A可抑制亚砷酸钠引起的Cdc2表达减少。8、将HPC2和Ring1在U2OS细胞内过表达之后,通过免疫共沉淀观察两者的结合。发现亚砷酸钠刺激细胞后,HPC2和Ring1的结合具有时间效应,随着刺激时间的延长,结合增多,30min的时候达到顶峰,随后减少。而将HPC2的突变体转入细胞后,发现T497位点突变后,HPC2与Ring1结合的能力减弱。HPC2的另一个位点突变体HPC2K494R与Ring的结合能力也明显下降。9、通过将野生型HPC2、HPC2T497A、HPC2T497E载体瞬时转染进U2OS细胞后,再给予亚砷酸钠刺激之后,固定细胞,通过免疫荧光技术观察HPC2在细胞内的定位,发现正常情况下HPC2散在分布于细胞核；而亚砷酸钠刺激之后,HPC2出现集中分布的情况,而将HPC2T497位点突变为丙氨酸之后,HPC2不再出现集中分布的斑块形态；而模拟磷酸化状态的HPC2T497E在没有亚砷酸钠刺激的情况下,也以斑块形态集中分布于细胞保护。10、通过将野生型HPC2、HPC2T497A、HPC2T497E和野生型RING1共转染进U20S细胞,再用针对HPC2和RING1的抗体标记两个蛋白,然后通过免疫荧光技术观察两个蛋白的定位,发现亚砷酸钠刺激可以募集RING1到HPC2所在的PcG小体；而HPC2T497A突变体失去了在亚砷酸钠刺激下募集RING1到PRC1小体的功能；而HPC2T497E突变体可以独立的募集RING1到PRC1小体。结论：1、亚砷酸钠通过减少Cdc2表达诱导U20S细胞G2/M期阻滞；2、激活p38可诱导U20S细胞G2/M期阻滞；3、干扰了HPC2表达可以抑制亚砷酸钠诱导的U20S细胞G2/M期阻滞；4、亚砷酸钠可诱导p38和HPC2在U20S细胞内结合；5、HPC2氨基末端的1到374位氨基酸负责与p38的结合；6、HPC2羧基末端的COOH盒与氨基末端的染色质盒协同参与HPC2与染色质的结合；7、HPC2的苏氨酸497位点的磷酸化促进HPC2与RING1的结合；8、HPC2赖氨酸494位点的SUMO化诱导HPC2和Ring1的结合；9、HPC2T497的磷酸化决定HPC2在细胞核内的定位,并募集RING1到HPC2所在的PRC1小体。10、HPC2的苏氨酸497位点的磷酸化介导了亚砷酸钠引起的cdc2转录抑制；11、HPC2T497的磷酸化参与了调节了亚砷酸钠引起的U2OS细胞G2/M期阻滞。