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少弱精子症是导致男性不育的重要原因,该病病因复杂,机制尚不明确。中医药在治疗少弱精子症方面积累了丰富的经验,具有独特的优势。益肾生精方来源于全国名老中医秦月好主任医师的临床经验方,治疗少弱精子症临床疗效确切,但其主要化学成分及其治疗少弱精子症的作用机制尚不明确,有待进一步研究。研究目的:本研究旨在分析益肾生精方的主要化学成分,并从整体动物水平上研究其治疗少弱精子症的药效和作用机制,为益肾生精方的临床应用提供依据。研究方法:1、益肾生精方中主要化学成分的鉴定:采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Exactive MS）技术进行检测,通过Xcalibur 2.2.0软件结合相关文献及标准品信息对益肾生精方中主要化学成分进行鉴定。2、益肾生精方治疗少弱精子症的药效学研究（1）环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）致少弱精子症大鼠模型造模剂量的探索:Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠24只,适应性饲养7 d后,按体质量随机分为正常对照组、CTX-25 mg/kg组、CTX-30 mg/kg组、CTX-35 mg/kg组,每组各6只。各造模组大鼠连续5 d腹腔注射相应剂量的环磷酰胺,正常对照组大鼠连续5 d腹腔注射同体积的生理盐水。继续观察28 d后,进行精子质量检测,确定合适的造模剂量。（2）益肾生精方的药效学评价:7周龄SD雄性大鼠56只,适应性饲养7 d后,随机选取8只大鼠为正常组,其余大鼠连续5 d腹腔注射环磷酰胺（35mg·kg-1·d-1）制备少弱精子症大鼠模型,正常对照组大鼠连续5 d腹腔注射同体积的生理盐水,造模结束后随机分为模型组、益肾生精方低、中、高剂量（2.91、5.83、11.66g·kg-1）组,五子衍宗丸（1.03g·kg-1）组,左卡尼汀（0.17g·kg-1）组,每组8只。对应药物干预28 d后,记录大鼠体质量、睾丸质量和指数,采用计算机辅助精子分析（computer-assisted sperm analysis,CASA）系统检测附睾中精子浓度和活力,苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察睾丸组织形态并进行评分,通过以上指标对益肾生精方治疗少弱精子症的疗效进行综合评价。3、益肾生精方治疗少弱精子症作用机制的初步研究（1）益肾生精方对少弱精子症大鼠睾丸组织中氧化应激的影响:比色法检测睾丸组织中丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量以及超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的活力变化。（2）益肾生精方对少弱精子症大鼠性腺轴的影响:通过酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测血清中卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone,FSH）、黄体生成素（Luteinizing hormone,LH）、睾酮（Testosterone,T）的水平,并计算下丘脑指数和垂体指数。（3）益肾生精方对少弱精子症大鼠睾丸组织中细胞凋亡的影响:原位末端标志法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）观察睾丸组织中细胞的凋亡情况并统计凋亡率,免疫印迹实验（Western blot,WB）测量睾丸组织中B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（BCL2-Associated X,Bax）以及活化的半胱天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase,cleaved-Caspase3）蛋白含量表达变化。研究结果:1、通过液质联用鉴定益肾生精中化学成分,共得到70种主要化学成分,其中包括37种黄酮类化合物,如槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、芦丁（Rutin）、葛根素（Puerarin）、柚皮苷（Naringin）、柚皮素（Naringenin）等;13种有机酸类化合物,如没食子酸（Gallic acid）、苹果酸（Malic acid）、阿魏酸（Ferulic Acid）、绿原酸（Chlorogenic acid）等;5种生物碱类化合物,如Morusimic acid D、Morusimic acid F等;15种其他类化合物,如洋川芎内酯F（Senkyunolide F）、丁香酚（Eugenol）等。2、环磷酰胺致少弱精子症大鼠模型造模剂量确立的实验结果表明:与正常对照组相比,实验结束时CTX-25、30、35 mg/kg三个组大鼠的体质量、睾丸质量、睾丸指数均明显下降（P＜0.05,P＜0.01）;CTX-35 mg/kg组大鼠的精子浓度和精子活力明显减少（P＜0.05）,CTX-25 mg/kg组和CTX-30 mg/kg组大鼠的精子浓度和精子活力有减少的趋势,但没有统计学差异（P＞0.05）。综上,环磷酰胺35 mg/kg/d连续腹腔注射5d可成功建立少弱精子症大鼠模型,该造模方法将用于之后的药效评价及机制研究中。益肾生精方治疗少弱精子症药效学的实验结果表明:与正常对照组相比,模型对照组大鼠的精神状态和活动力明显变差、毛色明显变暗发黄并严重脱落,大鼠的体质量、睾丸重量和指数显著下降（P＜0.01）,精子浓度和活力显著降低（P＜0.01）,睾丸出现生精细胞减少等病理形态、病理评分明显升高（P＜0.01）;与模型对照组相比,益肾生精方中、高剂量组,五子衍宗丸组和左卡尼汀组可明显改善大鼠的精神状态、活动力和毛色等,显著提高体重、睾丸重量和指数,并提高精子浓度和活力,降低睾丸病理评分（P＜0.05,P＜0.01）。3、益肾生精方治疗少弱精子症的作用机制研究:氧化应激水平检测结果显示,模型对照组大鼠睾丸组织中SOD活力显著降低（P＜0.01）,MDA含量显著升高（P＜0.01）,益肾生精方高剂量、五子衍宗丸和左卡尼汀可以明显提高SOD活性,降低MDA含量（P＜0.05,P＜0.01）。性激素水平检测结果显示,与正常对照组相比,模型对照组T含量显著降低（P＜0.01）、FSH和LH含量显著升高（P＜0.01）;益肾生精方中、高剂量、五子衍宗丸和左卡尼汀可以提高T含量（P＜0.01）,降低LH和FSH含量（P＜0.05,P＜0.01）。下丘脑、垂体重量及指数计算结果显示:模型对照组下丘脑重量、垂体重量明显下降（P＜0.05）,下丘脑指数和垂体指数有降低的趋势;益肾生精方高剂量和五子衍宗丸可以明显提高垂体指数（P＜0.05）。TUNEL结果显示,模型对照组生精细胞凋亡率显著增加（P＜0.01）;益肾生精方中剂量、五子衍宗丸和左卡尼汀可显著降低凋亡率（P＜0.01）。WB结果显示,模型对照组Bcl-2蛋白含量明显降低（P＜0.05）、Bax和cleaved-Caspase3蛋白含量明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;益肾生精方中、高剂量、五子衍宗丸和左卡尼汀可以明显升高Bcl-2蛋白含量,降低Bax和cleaved-Caspase3蛋白含量（P＜0.05,P＜0.01）。研究结论:（1）益肾生精方主要化学成分是黄酮类化合物（槲皮素、芦丁、山奈酚、柚皮素、葛根素等）,有机酸类化合物（没食子酸、绿原酸、原儿茶酸等）以及生物碱类等。（2）益肾生精方可显著提高少弱精子症模型大鼠的精子浓度和活力,改善睾丸病理损伤,增加体重、睾丸质量及指数。（3）益肾生精方通过抗氧化、调节性腺轴以及抑制细胞凋亡等多个途径发挥治疗少弱精子症的作用。