研究背景：随着分子生物学和组织工程学的发展,目前牙齿再生已经成为国内外研究的热点。牙齿再生组织工程包括单纯构建和全牙重建：单纯构建是将形成牙齿某一部分的细胞与相应支架材料复合后植入动物体内而成,目前此方面的研究已经取得一定进展；而全牙重建很复杂,涉及多种牙齿形成细胞的复合和不同类型支架材料的组合,这类研究进展缓慢。牙釉质是脊椎动物体内最硬的组织,模拟牙釉质的矿化过程,生产出具有再矿化能力的生物义齿一直是牙科医生的梦想。目前,生物矿化形成牙釉质的过程仍然建立在成釉细胞和蛋白质的相互作用基础上。成釉细胞是牙釉质的形成细胞,釉原蛋白(Amelogenin, AMEL)是釉质有机基质的主体,AMEL对釉质矿化的起始、晶核的形成及排列等诸多因素起着重要的调节作用。非AMEL包括釉蛋白和成釉蛋白(Ameloblastin, AMBN)等也被认为具有较广泛的促进晶体成核和影响晶体生长形态的作用。故任何影响成釉细胞生长及其蛋白质分泌的因素均能影响牙釉质的矿化过程。1,25-(OH)2D3作为维生素D甾体类激素的活化形式,对细胞的生长、分化及蛋白质的分泌等起着重要的调控作用,其受体在口腔组织中分布广泛,其中成釉细胞是VD的靶细胞之一。国外学者通过RT-PCR及Northern Blot等方法研究发现成釉细胞所分泌的AMEL的表达受1,25-(OH)2D3调控。然而,RT-PCR及Northern Blot均是从转录水平上检测目的基因,而非翻译水平,从转录水平到翻译水平还有复杂的过程,因此基因的表达量与蛋白的表达量不一定呈正相关.本研究通过体外培养猪成釉细胞,应用Western Blot法在蛋白质水平上检测不同浓度以及不同作用时间下的1,25-(OH)2D3对猪成釉细胞所分泌的特异性蛋白—AMEL及AMBN表达变化的影响,为牙釉质生物矿化的研究奠定实验基础。目的：1.分离培养猪成釉细胞,为进一步的研究提供实验基础。2.研究1,25-(OH)2D3在不同浓度以及不同作用时间下对体外培养的猪成釉细胞增殖的影响。3.在翻译水平上研究1,25-(OH)2D3在不同浓度以及不同作用时间下对体外培养的猪成釉细胞所分泌的特异性蛋白—AMEL及AMBN表达变化的影响。方法：1.细胞培养：选择约6月龄30kg重的西藏小型猪,无菌条件下取出磨牙牙胚,分离牙囊、牙乳头及成釉器。将成釉器组织剪成约1mm3大小的组织块,采用组织块法原代培养,酶消化法进行传代培养。2.细胞鉴定：通过免疫细胞化学方法检测所培养细胞的波形丝蛋白和角蛋白的表达,对细胞来源进行初步鉴定。采用成釉细胞特异性蛋白—AMEL抗体对培养细胞进行定性。3.浓度梯度的1,25-(OH)2D3 (0、1×10-10、1×10-8、1×10-6mol/L)作用于体外培养的猪成釉细胞,分别在加药后1天、3天、5天,利用MTT法检测细胞的增殖情况。4.浓度梯度的1,25-(OH)2D3 (0、1×10-10、1×10-8、1×10-6mol/L)作用于体外培养的猪成釉细胞,分别在加药后1天、3天、5天,用Western免疫印迹检测其分泌的AMEL及AMBN的表达水平。结果：1.细胞形态学特征：猪成釉细胞呈上皮细胞样,细胞形态多样,呈圆形’或多角形等,可见多核、丝状伪足、锯齿状边缘。部分细胞含有明显的颗粒样物质,可能为星网层细胞。在卵圆形的上皮细胞中间可见大细胞样细胞,而不像成纤维细胞(长梭形,胞体较小,胞核较大,居中,核仁清晰),在培养过程中随着细胞培养时间及代数的增长,大细胞样细胞逐渐盛行且不能继续增殖。2.免疫细胞化学染色结果显示细胞角蛋白-14染色胞浆呈棕黄着色,阳性,而波形丝蛋白染色胞浆无着色,阴性,表明该细胞为上皮来源。细胞特异性抗AMEL抗体染色胞浆呈棕黄着色,阳性,表明该细胞为成釉细胞。3.MTT检测结果显示,在同一作用时间点上,1,25-(OH)2D3在1×10-10～1×10-6mol/L浓度范围内对猪成釉细胞的增殖均有明显的抑制作用,其中1×10-6mol/L组作用最强,1×10-10mol/L组作用最弱,各实验组与对照组之间,各实验组之间均相差显著(P<0.05)。在相同浓度的1,25-(OH)2D3作用下,随作用时间的增长,1,25-(OH)2D33抑制细胞增殖的作用也逐渐增强,细胞增殖趋势明显减缓,各实验组之间均相差显著(P<0.05),呈现一定的时间依赖性。4.Western Blot检测结果显示,在相同浓度的1,25-(OH)2D3作用下,随作用时间的增长,AMEL及AMBN的表达均增强,各实验组之间均相差显著(P<0.05)；在同一作用时间点上,随1,25-(OH)2D3浓度的升高,AMEL的表达逐渐增强,而AMBN的表达逐渐减弱。各实验组与对照组之间,各实验组之间均相差显著(P<0.05)。结论：5.猪成釉细胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中生长良好,且可在较长时间内维持其上皮样形态和生物学特性。6.1,25-(OH)2D3在体外可以抑制猪成釉细胞的增殖。7.1,25-(OH)2D3在体外可影响猪成釉细胞分泌的特异性蛋白——AMEL及AMBN的表达,通过调节AMEL及AMBN在牙釉质中相对含量的变化,从而影响牙釉质的矿化过程。