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背景与目的碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用乃至滥用,造成耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)不断涌现,并已成为当前研究的热点。资料显示,CRE广泛分布于人、动物、环境中,并在全球多个国家被报道。进一步的研究表明,在中国、美国及欧洲多个国家所分离CRE菌株中,碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)所占比例达60%～90%,其所致感染也已经造成高达40%～50%的临床死亡率。2016年,世界卫生组织已经将CRKP菌株列为重点关注对象。产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制,其中,KPC型碳青霉烯酶最常见。KPC型碳青霉烯酶于1996年首次在美国发现,之后产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(KPC-producing Klebsiella pneumoniae,KPC-Kp)在美国爆发流行,目前在全球多个国家,包括阿根廷,巴西,哥伦比亚,中国,希腊,以色列,意大利,波兰和法国等均有传播蔓延报道。KPC存在多个突变体,其中以KPC-2和KPC-3最常见。值得注意的是,KPC-Kp菌株存在多种ST型别,但是全球大范围的播散主要局限于CC258克隆复合体,包括ST258、ST11、ST340和ST512。其中ST258是北美,拉丁美洲和欧洲最流行的型别。在亚洲地区尤其是我国,ST11型别是主要克隆型别,约占CRKP菌株的60%。既往研究表明,KPC的大流行是由于CC258复合体菌株的克隆传播,另有研究发现blaKPC还可通过质粒、可移动基因元件等方式在菌株之间水平转移。而且,多种不同复制类型的质粒包括IncF,IncI2,IncX,IncA/C,IncR和ColE1中均可携带blaKPC。blaKPC在菌株间如此复杂的传播方式,使得临床对于KPC-Kp菌株流行与传播的遏制成为一大难题。同时,不同地区的CRKP菌株的分子特征及传播机制、基因环境等有所差异,因此可采取的感染控制措施也不尽相同。当前,二三代测序技术以及生物信息学飞速发展与应用,使得我们可以深入地研究菌株的耐药以及传播的分子机制。结合流行病学数据,可利于早期识别菌株传播途径,及时阻断菌株感染的爆发。基于上述,我们设计了本课题,旨在探究杭州地区分离的CRKP菌株的耐药机制,并通过测序技术以及相应的生物信息学分析,深入研究KPC-Kp菌株的分子特征、基因环境以及传播方式,为临床控制此类细菌的蔓延提供实验室依据。方法1.收集杭州某三级医院经鉴定为CRKP菌株268株,并收集患者的临床资料。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)重新鉴定菌种,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增常见的碳青霉烯类耐药基因(blaKPC,blaNDM,blaIMP,blaVIM,blaOXA-48),并将 PCR 阳性产物进行测序确证,完成本实验232株KPC-Kp菌株的确认。2.通过琼脂稀释法及微量肉汤稀释法确定实验菌株的耐药表型。3.采用S1酶切PFGE分析菌株携带质粒的数目及质粒大小,结合Southern印迹杂交试验进行blaKPC耐药基因的定位,通过质粒接合试验和接合子体外药敏试验判断blaKPC耐药基因所在质粒的转移性。4.提取细菌DNA进行全基因组测序分析(whole-genome sequencing,WGS),并通过SPAdes拼接软件以及Prokka注释软件获得细菌基因组的fasta文件以及gbk文件。5.通过Plasmidfinder在线网站查找KPC-Kp菌株携带质粒的复制类型,采用Resfinder在线网页查找菌株携带的耐药基因,以及耐药基因所在的contig,MLST数据库分析菌株的ST型,Easyfig软件构建blaKPC耐药基因的周围环境。结果1.2018年11月1日至2019年6月30日期间共收集268株CRKP菌株,其中232株携带blaKPC-2耐药基因,8株携带blaNDM-1基因,2株携带blaNDM-5基因。其中一株为blaKPC-2与blaNDM-1共存,一株为blaKPC-2与blaNDM-5共存。2.232株菌株大多分离自呼吸道标本,并且绝大多数来自重症监护病房(intensive care unit,ICU)。3.232株菌株全部为多重耐药菌,所有菌株对哌拉西林-他唑巴坦、头孢噻肟、头孢他定、氨曲南中介或耐药。除了3株菌对头孢匹罗为剂量依赖性敏感之外,其余均为耐药。菌株对亚胺培南和美罗培南的不敏感率分别为94.86%、96.57%,对氨基糖苷类药物阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星的耐药率分别达82.86%、94.86%、97.97%。对甲氧苄啶-磺胺甲恶唑、磷霉素、氯霉素耐药率分别为55.43%、56.00%、58.86%。对多粘菌素和替加环素的不敏感率分别为8.62%和 5.17%。4.除了碳青霉烯类耐药基因外,232株菌株携带多种其他种类耐药基因,包括产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum-β-lactamases,ESBLs)相关耐药基因、头孢菌素酶相关耐药基因以及喹诺酮类、氨基糖苷类、磷霉素、四环素、氯霉素、大环内酯类、磺胺类等耐药基因。5.ST11型是KPC-Kp菌株的主要型别。6.KPC-Kp菌株携带1～4个不同大小和复制类型的质粒,其中IncFII最常见。除了 1株肺炎克雷伯菌株携带的blaKPC耐药基因位于染色体上之外,其余均定位于质粒上。7.blaKPC的周围环境共有21种,其中ISKpn27-blaKPC是其保守序列。结论1.产KPC-2型碳青霉烯酶是本地区CRKP菌株的主要耐药机制,且KPC-Kp菌株可携带多种其他耐药基因,导致临床治疗失败。2.ST11型KPC-Kp菌株的克隆传播是促进本院blaKPC基因播散的关键因素。3.blaKPC的基因环境呈多样性,ISKpn27-blaKPC-2是其保守序列。