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随着胚胎工程技术的深入研究,牛卵母细胞体外受精技术的应用范围已越来越广泛,不仅为牛胚胎移植技术的商业化发展提供了更为廉价的胚胎来源,更为研究动物生殖机能、生殖细胞的体内发育机制以及解决现实生产中的外界应激因素对动物生殖机能的影响机制搭建了技术平台。热应激(heatstress)是世界范围内普遍存在的、对奶牛生殖力影响较大的环境因素,而IGF-Ⅰ对胚胎早期发育则具有显著的促进作用,但IGF-Ⅰ在牛卵母细胞体外成熟阶段的影响作用仍不明确。本研究首先对卵母细胞的体外成熟、体外受精及体外培养过程中的一些影响因素进行了科学实验,并利用成熟的牛卵母细胞体外受精技术对热应激(heat shock,HS)影响卵母细胞发育能力进行了细胞及分子水平的研究,并对引起人们广泛关注的IGF-Ⅰ在卵母细胞体外成熟前后对卵母细胞发育能力的影响进行了多个组合的对比研究。
主要研究结果如下:
实验一、正常体温条件下牛卵母细胞体外成熟、受精及早期胚胎体外培养技术研究
1)牛卵母细胞体外成熟因素研究
屠宰场获取卵巢后的卵巢离体保存时间在6h以内时对卵母细胞的体外成熟率无影响,超过6h后成熟率下降;获卵卵泡直径在2mm以内时卵母细胞的体外成熟率较低(51.66±3.15),直径大于2mm后,尽管成熟率随卵泡直径的增加而呈增加趋势,但卵泡直径在2-6mm,7-8mm及9-10mm时的卵母细胞成熟率间并无显著差异(80.73±2.81,84.32±1.85,87.27±6.23,P＞0.05);A、B级COCs的卵母细胞成熟率较高(85.92±3.35vs82.47±3.24,P＞0.05),C级COCs的成熟率显著下将(60.26±5.46,P＜0.05),D级COCs的成熟率最低(18.23±4.15,P＜0.05)。
2)牛卵母细胞体外受精因素研究
卵泡直径对卵母细胞体外受精后的卵裂率有较大影响,随卵泡直径增加而显著增加(P＜0.05)。卵泡直径对囊胚率也有一定影响,当直径小于2mm时囊胚率仅为6.37±2.58,直径在2-8mm之间时囊胚率显著增加(24.73±1.63,28.21±1.89,P＞0.05),直径在9-10mm的囊胚率显著高于除7-8mm外的其它各组(31.43±7.49,P＜0.05);体外受精前卵丘细胞完全保留或部分保留对卵裂率及囊胚率均无影响,但完全脱除卵丘细胞使卵裂率及囊胚率显著降低;精卵共孵育时间在8-18h之间的各时间段间对卵母细胞的发育能力无影响。
3)牛早期胚胎体外培养因素研究
每24h或48h对胚胎培养液进行半量更换对卵裂率及囊胚率的影响并不显著,与对照组的结果无差异,但在胚胎培养的第3天补充10％的FCS对囊胚的发育具有促进作用。
实验二、热应激(HS)条件下IGF-Ⅰ对牛卵母细胞体外发育能力的影响研究
1)GV期牛卵母细胞在热应激条件下添加IGF-Ⅰ对其发育能力的影响
HS条件及IGF-Ⅰ对IVM后卵母细胞胞质内皮质颗粒的分布、核成熟及核凋亡均未产生任何影响。
2)热应激条件下牛卵母细胞体外成熟时IGF-Ⅰ的添加对其发育能力的影响
HS显著降低了IVF后的卵裂率(CvsHS为75.60±3.54.vs56.55±5.24,P＜0.05),并降低了IVF后42h时超过2-细胞胚胎的比率(CvsHS为39.11±5.17vs22.66±4.99,P＜0.05)。但IGF-Ⅰ仅使LCR组中2-细胞胚胎与所有超过2-细胞的胚胎间的比率有降低趋势(3.42±0.53％vs1.8±0.53％;P＜0.1);HS及IGF-Ⅰ对IVM后胞质内皮质颗粒的分布未产生任何影响;HS显著增加了处于MI期卵母细胞的比率(CvsHS为1.75±1.75vs39.34±5.39,P＜0.05),同时降低了MⅡ期卵母细胞的比率(CvsHS为57.9±13.27vs13.91±4.16,P＜0.05)。HS组中处于晚期核成熟阶段(TeloⅠ及MⅡ)的卵母细胞比率显著低于C组(P＜0.01),IGF-Ⅰ在热应激条件下轻微增加了处于晚期核成熟卵母细胞的比率,但差异并不显著(P＞0.05);C组中TUNEL阳性卵母细胞的比率低于HS组(27.98±5.95vs47.94±14.24:P≤0.09),在热应激条件下,IGF-Ⅰ的添加使TUNEL阳性卵母细胞的比率降至对照组水平,但并无显著差异。热应激及IGF-Ⅰ对4-细胞期胚胎中GAPDH及GDF9的表达水平无显著影响。