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真菌免疫调节蛋白(fugal immunomodulatory protein,FIP)是从一些高等担子菌子实体中提取的与植物凝集素和免疫球蛋白的结构和免疫功能相似的一类小分子蛋白质。到目前为止,已分离得到了7种FIPs,即分别从赤芝(Ganoderma lucidum)、松杉灵芝(G. tsugae)、金针菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、紫芝(G. japoncium)、小孢灵芝(G. microsporum)及紫芝(G. sinensis)中分离得到的LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja、FIP-gmi及FIP-gsi。FIPs具有与凝集素相似的活性,能够促进血细胞凝集。在免疫调节功能上,FIPs能够促使淋巴细胞增殖,以及诱导淋巴细胞产生细胞因子。本论文利用同源克隆的方法,从赤芝(G. lucidum)、紫芝(G. sinensis)及金针菇(F. velutipes)中分别克隆到了真菌免疫调节蛋白基因,并构建原核表达载体pQE-FIP-glu、pQE-FIP-gsi及pQE-FIP-fve。将构建的原核表达载体转化进大肠杆菌(Escherichia coli) M15宿主细胞,通过使用IPTG诱导使其表达重组赤芝、紫芝及金针菇真菌免疫调节蛋白。利用Ni-NTA柱纯化蛋白后,一方面用于多克隆抗体的制备;另一方面用于诱导小鼠脾细胞细胞因子表达实验。SDS-PAGE实验显示,利用大肠杆菌成功表达出了重组赤芝、紫芝及金针菇真菌免疫调节蛋白。BandScan V 5.0软件分析显示,表达的重组FIP-glu占大肠杆菌总蛋白的51.1%,其中可溶性重组FIP-glu占大肠杆菌总可溶性蛋白的55.4%,纯化后其纯度达到90%;表达的重组FIP-gsi占大肠杆菌总蛋白的41.7%,其中可溶性重组FIP-gsi占大肠杆菌总可溶性蛋白的46.1%,纯化后其纯度达到90%;表达的重组FIP-fve占大肠杆菌总蛋白的36.7%,其中可溶性重组FIP-fve占大肠杆菌总可溶性蛋白的5.4%,纯化后其纯度达到90%。通过MALDI-MS证实,表达的蛋白为重组的赤芝、紫芝及金针菇真菌免疫调节蛋白。Western Blot实验表明,表达的蛋白具有一定的免疫源性。将纯化的重组赤芝、紫芝及金针菇真菌免疫调节蛋白分别免疫新西兰大耳白兔,从而获得兔抗赤芝、紫芝及金针菇真菌免疫调节蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,其效价均达到了1:625,000。Western Blot检测多抗,结果显示有明显特异条带。通过RT-PCR检测,证实重组的赤芝、紫芝及金针菇真菌免疫调节蛋白对小鼠脾细胞细胞因子的转录具有诱导作用。赤芝真菌免疫调节蛋白及紫芝真菌免疫调节蛋白能够诱导细胞因子interleukin (IL)-2、IL-3、IL-4、interferon (IFN)-γ、tumour necrosis factor (TNF)-α及IL-2 receptor (IL-2R)的转录表达,金针菇真菌免疫调节蛋白能够诱导细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、lymphotoxin (LT)及IL-2R的转录表达。本论文利用DNA改组技术,对赤芝、紫芝及赤芝、金针菇、草菇这两组真菌免疫调节蛋白基因进行改组初步研究。经过两轮PCR结果显示,通过改组实验,FIP基因在这两组内分别发生了基因片段的重组。得到的新基因分别包含了这两组基因的基因片段,从而实现了DNA分子的体外重组。本论文利用染色体步移技术,从金针菇基因组DNA中克隆到了一条长1 kb的真菌免疫调节蛋白基因启动子。在NCBI数据库中未发现有与该序列相同或相似的序列,因此该序列为一新的序列。对克隆到的真菌免疫调节蛋白基因启动子序列进行生物信息学分析,结果显示该序列含有多种基序。其中主要含有7个TATA-box、7个CAAT-box、1个G-box、1个ABRE、3个CGTCA-motif以及6个Skn-1 motif。预测转录起始位点位于ATG上游100 bp处。将该序列克隆到植物表达载体pCAMBIA 1304中,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA 105转化进烟草(Nicotiana tabacum)。通过GUS染色及荧光检测,发现该启动子在叶表皮毛及根部特异表达。