论文部分内容阅读
粘虫Mythimna separata(Walker)隶属于昆虫纲(Insecta)鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae),是危害我国三大粮食作物的重大害虫。目前,粘虫防治常利用生物防治和化学防治等手段。长期使用农药不仅会引起害虫体内产生抗性,还会造成环境污染,影响人类的安全。随着分子生物学技术不断发展,利用寄主植物介导的RNAi技术是害虫绿色防控新技术,已经成为现阶段农作物抗虫基因工程的热点之一。目前,寄主植物介导的RNAi技术应用在粘虫中的研究报道较少。本文拟以几丁质合酶B(Chitin synthase B,CHSB)为靶标基因,探究该技术对粘虫RNA干扰效果及几丁质合酶B的功能,可为利用RNAi技术进行害虫防治提供基础数据,同时丰富昆虫CHSB基因功能知识。本研究运用RT-qPCR技术,建立了粘虫幼虫CHSB基因的时空表达模式;进一步依据植物VIGS技术原理,借助于烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)载体,以CHSB基因为靶标基因,以玉米(郑单985)为寄主植物,建立了玉米介导粘虫有效RNAi体系,并探究了粘虫CHSB的生理功能。1.粘虫幼虫CHSB基因时空表达模式的建立。基于粘虫CHSB基因c DNA序列(登陆号:KY348776),利用Primer-BLAST在线软件设计实时荧光定量引物。运用RT-q PCR技术,以β-actin为内参基因检测粘虫5龄幼虫头部、表皮、前肠、中肠、后肠、马氏管和脂肪体等7种组织中CHSB的m RNA水平。结果显示,CHSB基因的m RNA在粘虫7种组织中均有表达。在中肠中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在前肠和后肠中次之,而在头部、表皮、马氏管和脂肪体中的表达量极低,但组织之间没有显著差异(P>0.05)。表明该基因参与前肠和后肠几丁质内膜及中肠围食膜几丁质的合成,该酶主要在消化道特异性表达。进一步检测了各个龄期粘虫中肠CHSB基因m RNA的表达水平。实验结果显示,该基因在粘虫幼虫1-6龄中肠中均有表达,m RNA总体水平随幼虫龄期的增长而升高。1龄CHSB m RNA水平显著低于其他龄期(P<0.05),2-5龄CHSB m RNA表达相对稳定,但3龄呈显著性增高(P<0.05)。6龄CHSB m RNA水平极显著高于其他龄期(P<0.01)。CHSB的表达随粘虫龄期的增长而发生变化,可能与幼虫啃食物的能力和取食量随虫龄的增长而增加有关。因为食量的增加需要更多的几丁质合酶合成更多的几丁质形成围食膜来保护消化道避免机械损伤。由此可见,CHSB基因参与粘虫幼虫围食膜几丁质的形成。2.玉米介导粘虫RNAi体系的建立。利用Primer-BLAST在线软件在粘虫CHSB基因编码区内确定干扰靶标序列,分别在上下游引物的5’端加上Bam HI和Kpn I限制性内切酶位点序列。利用PCR技术克隆获得带有酶切位点的干扰片段,经过双酶切后分别与p TRV2和p TRV2GFP(携带绿色荧光蛋白的p TRV2质粒)表达载体重组,获得p TRV2-CHSB、p TRV2-GFP和p TRV2GFP-CHSB(便于利用GFP荧光筛选转化成功植株)重组质粒。通过农杆菌GV3101介导,将含p TRV2-CHSB、p TRV2GFP-CHSB和p TRV2-GFP重组质粒(实验室提供)的农杆菌菌液分别与含p TRV1质粒的菌液按1:1比例混合,通过真空渗透转化玉米胚芽。从DNA和RNA水平检测出土第15天玉米苗中重组质粒转化与CHSB和GFP的ds RNA表达情况。结果显示,在出芽后第15天玉米苗中可检测到重组质粒DNA以及CHSB和GFP的ds RNA。选取3株转化成功的玉米苗进行田间试验,60天后在玉米顶叶与花粉中均可以检测到重组质粒DNA。用GFP荧光观察第5天p TRV2GFP-CHSB重组质粒转化的玉米苗,可见明显的绿色荧光斑点,说明p TRV2GFP可以用做工程载体。3.粘虫RNAi沉默效果鉴定。实验设置空白对照组、阴性对照组(p TRV2、p TRV2-GFP)和实验组(p TRV2-CHSB、p TRV2GFP-CHSB),每个对照组3个生物学重复,每个重复处理6-10头同一批3龄第2天试虫。通过RT-PCR技术分析CHSB的沉默效率。结果显示,对照组(空白对照、p TRV2和p TRV2-GFP)之间CHSB基因的m RNA水平没有显著差异(P>0.05),实验组CHSB基因的m RNA水平极显著低于对照组(P<0.01)。实验组(p TRV2-CHSB和p TRV2GFP-CHSB)之间CHSB基因的m RNA水平不存在显著差异(P>0.05)。表明饲喂表达CHSB-ds RNA的玉米苗可以抑制粘虫体内CHSB基因的表达。观察和记录粘虫蜕皮后头壳宽度、体长、5龄第2天粪便干重、发育历期和死亡率。结果显示,对照组和实验组之间头壳宽度没有显著性差异(P>0.05),实验组的体长显著短于对照组(P<0.05),实验组的粪便干重显著重于对照组(P<0.05),实验组的发育历期显著长于对照组(P<0.05),实验组的死亡率(p TRV2-CHSB为53.3%、p TRV2GFP-CHSB为56.7%)显著高于对照组的死亡率(P<0.05)。死亡个体表现出表皮不正常,且肛门处有大量液体便出。结果表明CHSB基因不仅参与合成粘虫幼虫中肠围食膜,也参与表皮几丁质的形成。综上所示,本实验以粘虫幼虫为研究对象,运用RT-qPCR技术建立了粘虫幼虫CHSB基因的时空表达情况;并依据植物VIGS技术原理,构建了TRV病毒载体介导玉米表达粘虫靶基因ds RNA体系,通过靶基因CHSB来验证了该RNAi技术的可行性以及丰富粘虫CHSB基因的生理功能。